乳腺癌淋巴微轉移模型的建立及皮內與靜脈注射18F-脫氧葡萄糖的診斷效果

李永霞，鄭營營，孫玉云，何思敏,4，羅建民，張建平,4，曹天野,4，王明偉,4，章英劍,4

1.復旦大學附屬腫瘤醫院核醫學科，復旦大學上海醫學院腫瘤學系，上海200032；

2.復旦大學生物醫學影像研究中心，上海200032；

3.上海市質子重離子醫院核醫學科，上海201315；

4.上海分子影像探針工程技術研究中心，上海200032

［關鍵字］ 乳腺癌；淋巴結微轉移；皮內注射；靜脈注射；18F-脫氧葡萄糖PET/CT成像

靜脈注射18F-脫氧葡萄糖（18F-fluorodeoxyglucose，18F-FDG）后的代謝顯像已廣泛用于惡性腫瘤分期和療效評價［1］，包括用于乳腺癌腋窩淋巴結和內乳淋巴結轉移的診斷［2-4］。近年來有研究者采用手持型高能γ探測器，用于18F-FDG靜脈注射后術中指導乳腺癌病灶清除［5］，還有研究者采用局部皮內注射18F-FDG進行小鼠前哨淋巴結顯像［6］，提出“正電子淋巴結顯像”（positron lymphography）的概念。本研究構建乳腺癌淋巴微轉移小鼠模型，比較區域性皮內與靜脈注射18F-FDG后小鼠PET/CT成像，以評估不同注射方式下18F-FDG PET/CT對乳腺癌淋巴結微轉移成像的效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和動物

4T1乳腺癌腫瘤細胞購自中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。SPF級8周齡BALB/c雌性裸鼠6只，體質量20～25 g，購于復旦大學上海醫學院實驗動物部，顯像前2周于實驗中心飼養。

1.1.2 試劑和儀器

18F-FDG和99mTc-SC由本科室自制。DMEM培養基購自Gibco公司。小動物PET/CT（型號Inveon，購自德國Siemens公司）、小動物SPECT/CT（型號Bioscan，匈牙利Mediso公司）均為本科室擁有。

1.1.3 細胞培養及腫瘤淋巴微轉移動物模型的建立

細胞培養主要參考美國模式培養物保藏所（American Type Culture Collection，ATCC）提供的方法。4T1細胞用DMEM培養基，于37 ℃、CO2體積分數為5%的細胞培養箱中常規培養，每3～4 d在細胞對數生長期時按1∶3傳代培養。以無血清DMEM培養基洗滌，調整活細胞密度為1×106個/mL，制成細胞懸濁液，分別在6只雌性裸鼠右側第二乳房脂肪墊內注射0.1 mL。成瘤3 d后，手術取出部分瘤，術后第11天成像。有創傷操作均在潔凈麻醉下進行。小鼠飼養于標準動物房。

1.2 研究方法

1.2.1 荷瘤小鼠淋巴結PET/CT和SPECT/CT顯像

嚴格遵守《實驗動物科學與管理》，所有操作過程均于麻醉（1%～2%異氟烷與空氣混合物）狀態下進行。每次18F-FDG成像前禁食4 h，先在左、右前爪皮內分別等量注射3.7 MBq18F-FDG，總劑量為7.4 MBq，1 h后小動物PET/CT顯像；24 h后尾靜脈注射7.4 MBq18F-FDG，再次顯像。PET/CT顯像按三維模式采集10 min靜態圖像，并采用OSEM3D/MAP法重建，獲得衰減校正后的PET/CT融合圖像。然后在疑似有淋巴結微轉移的荷瘤鼠左、右兩側前爪皮內分別注射3.7 MBq锝硫膠體（technetium sulfur colloid，99mTc-SC），1 h后進行SPECT/CT靜態顯像，并測量瘤周淋巴結和對側淋巴結放射性占注入量的百分比（%ID/g）。

顯像后處死裸鼠，摘取腫瘤組織、瘤周淋巴結和對側淋巴結標本，用10%中性甲醛溶液固定。

1.2.2 病理學分析

荷瘤裸鼠腫瘤組織經10%甲醛溶液固定，石蠟包埋，常規脫水，透明，浸蠟，切片厚5 μm，行H-E染色。用SAB法分別檢測腫瘤組織、瘤周轉移淋巴結、對側陰性淋巴結中上皮細胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）和葡萄糖轉運蛋白1（Glut-1）的水平。

1.2.3 統計學處理

采用Image-Pro Plus 6.0分析陽性細胞率，SPSS 19.0軟件進行統計分析，計量數據以x±s表示，單因素方差分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 18F-FDG不同注射方式下荷瘤小鼠PET/CT成像差異

前爪皮內注射18F-FDG后，有2只小鼠瘤周腋下淋巴結攝取值異常增高，ID%/g值為19.2±2.0，明顯高于對側淋巴結（ID%/g為6.8±0.4）及其他4只小鼠相同位置淋巴結（ID%/g為7.2±0.4）（P＜0.001；圖1A）。靜脈注射時，所有小鼠瘤周腋下淋巴結幾乎與背景相當（圖1B），ID%/g值為2.5±0.5。

此外，瘤周淋巴結攝取較高的荷瘤小鼠前爪皮內注射傳統淋巴結顯像劑99mTc-SC后1 h，可觀測到細長淋巴引流區域，兩側出現4個放射性攝取增高淋巴結，ID%/g值約為0.32±0.3，差異無統計學意義（P=0.415）。瘤周側的一個淋巴結與18F-FDG高攝取淋巴結位置相吻合。

2.2 4T1乳腺癌淋巴結微轉移的免疫組織化學結果

圖1 不同注射方式下的PET和SPECT成像圖及攝取值A：同一只荷瘤小鼠，前爪皮內注射；B：尾部靜脈注射18F-FDG后1 h的腫瘤PET/CT成像剖面圖（n=3）；C：前爪皮內注射淋巴顯像劑99mTc-SC后1 h SPECT/CT成像的腫瘤最大密度投影圖和剖面圖（n=3）

解剖后發現，皮內注射18F-FDG攝取較高的小鼠（2/6）瘤周淋巴結為紅色稍大淋巴結（圖2），CK5/6呈強陽性，陽性率為（73.9±7.1）%。HE染色顯示淋巴結結構未發生破壞，證明其為微轉移淋巴結［7］。定量分析18F-FDG攝取較低小鼠（4/6）的瘤周淋巴結，CK5/6陽性率為（10.1±4.7）%（P＜0.000 2）。此外，陽性轉移淋巴結中Glut-1陽性率為（51.9 ±11.5）%，明顯高于陰性淋巴結的（15.2±1.3）%（P＜0.01）。

圖2 組織病例特性鑒定A：腫瘤組織、陽性轉移淋巴結和陰性淋巴結的H-E染色及免疫組織化學染色（×200）；B～C：不同組織中CK5/6（B）和Glut-1（C）的陽性表達率

3 討 論

前哨淋巴結活檢較多用于乳腺癌、黑色素瘤及子宮頸癌等的淋巴結分期、預后分析和決定是否進行淋巴結清掃［8］。該方法通常使用染料和（或）放射性藥物99mTc-SC在瘤周皮內局部注射以定位前哨淋巴結，然后通過病理分析觀察其是否有轉移，如有轉移則進一步開展淋巴結清掃［9-11］。因此，這類“淋巴結顯像術”僅適用于前哨淋巴結定位，不能定性。雖然其定位準確率達94%［12］，但識別淋巴結是否轉移或微轉移有賴于病理學檢查結果。此外，注射過量或注射壓力不當會使區域淋巴結過量顯示，難以決定前哨淋巴結數量［13］。靜脈注射18F-FDG后全身PET/CT顯像，可發現較大的轉移性淋巴結，這些宏轉移淋巴結中通常葡萄糖代謝增高；而靜脈注射18F-FDG使放射性呈全身分布，微轉移淋巴結常因放射性攝入不足而難以顯示。

Thorek等［6］首次提出“正電子淋巴顯像”，證實可通過皮內注射18F-FDG定位正常小鼠淋巴結位置，1 h后淋巴結ID%/g值為2～8，與本研究陰性淋巴結的ID%/g值（7.2±0.4）相當。轉移淋巴結高攝取的原因，可能主要是局部注射后經淋巴管進入淋巴結的放射性濃度遠高于靜脈注射法，從而容易顯示腫瘤細胞數量不多但葡萄糖代謝增高的微轉移，這一點與轉移淋巴結和陰性淋巴結的Glut-1陽性率相吻合。

本研究建立的乳腺癌淋巴結微轉移模型證實，局部注射18F-FDG比靜脈注射能更好地顯示淋巴結轉移，原位接種再手術去除部分瘤體的方法可促使淋巴結微轉移。淋巴結CK5/6結果證實轉移率約為33%（2/6），與局部皮內注射18F-FDG成像判斷的淋巴結轉移率一致。值得一提的是，只有陽性淋巴結有較高的18F-FDG攝取，其余瘤周陰性淋巴結則不然。目前，國外正在進行多項臨床試驗，以驗證不同注射方式（瘤內、間質注射等）下的“正電子淋巴顯像”效果（臨床試驗編號：NCT02285192），其結果將于近幾年公布。此外，“正電子淋巴顯像”可結合“切倫科夫成像”幫助術中清掃淋巴結［6］，但臨床上可能會遇到一些問題，如人體成像相對于動物實驗需更長采集時間，人體組織也可能對切倫科夫信號有干擾。因此，“正電子淋巴顯像”的臨床應用尚需時日。

綜上所述，本研究構建了小鼠乳腺癌淋巴結微轉移模型，對比不同注射方式（局部皮內與靜脈注射）及不同顯像劑（18F-FDG與99mTc-SC）時瘤周淋巴結成像，發現皮內注射18F-FDG能更好地實現術前診斷乳腺癌淋巴結微轉移。