164例抗核抗體斑點型陽性者血清抗核抗體譜聚類分析

羅雯斌，王曄愷，于 倩，林奇龍

（舟山醫院檢驗中心，浙江 舟山 316000）

自身抗體是針對自身組織、器官、細胞及細胞成分的抗體，是自身免疫性疾病（autoimmune disease，AID）的重要標志[1]。臨床上比較常見的自身抗體檢測項目包括抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）、ANA譜和抗雙鏈DNA（double-stranded DNA，ds-DNA）抗體，這3項指標檢測相對方便，也是AID的重要標志物[2]。ANA雖然本身不能單獨診斷任何疾病，但對于系統性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）、混合性結締組織病（mixed connective tissue disease，MCTD）、干燥綜合征（Sj?gren's syndrome，SS）等疾病具有重要的支持診斷和預后判斷意義[3]。斑點型作為ANA核型中的重要組成部分，在診斷上述疾病中有著非常重要的意義。為了探討ANA斑點型陽性者血清ANA譜的特征，本研究通過聚類分析研究ANA斑點型陽性者不同類型ANA的聚類現象以及不同類別與實驗室指標的相關性，為臨床診斷AID提供依據。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2014年8月—2016年8月舟山醫院門診和住院患者中ANA斑點型陽性者164例，其中男38例、女126例，年齡（53.6±11.2）歲，經臨床明確診斷，符合中華醫學會風濕病學分會和美國風濕病學會（American College of Rheumatology，ACR）的診斷標準[4-5]，包括類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）57例、 SLE 29例、SS 60例、MCTD 18例。采用非抗凝真空管采集所有患者靜脈血4 mL，靜置30 min后，894×g離心10 min，分離血清。

1.2 方法

1.2.1 全血細胞測定 采用LH750全自動血液分析儀（美國Beckman-Coulter公司）及配套試劑檢測白細胞（white blood cell，WBC）、血紅蛋白（hemoglobin，Hb）和血小板（platelet，PLT）。

1.2.2 抗環瓜氨酸肽（cyclic citrullinated peptide，CCP）抗體測定 抗CCP抗體采用金標法測定，試劑盒購自上海科新生物技術有限公司，嚴格按試劑說明書操作。

1.2.3 生化及免疫指標測定 采用AU640全自動生化分析儀（日本Olympus公司）及配套試劑檢測丙氨酸氨基轉移酶（alanine aminotransferase，ALT）、天門冬氨酸氨基轉移酶（aspartate aminotransferase，AST）、總膽紅素（total bilirubin，TB）、球蛋白（globulin，GLB）、肌酐（creatinine，Cr）、尿素水平。采用IMMAGE 800全自動特定蛋白分析儀（美國Beckman-Coulter公司）及配套試劑檢測抗鏈球菌溶血素O（anti-streptococcal hemolysin O，ASO）、類風濕因子（rheumatoid factor，RF）、C反應蛋白（C-reactive protein，CRP）、免疫球蛋白A（immunoglobulin A，IgA）、免疫球蛋白M（immunoglobulin M，IgM）、免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）、補體（complement，C） 3、C4。

1.2.4 ANA測定 分別采用間接免疫熒光法（indirect immunofluorescence，IIF）和免疫印跡法平行檢測ANA和ANA譜。在IIF測定中，抗體效價≥1∶100即視為ANA陽性。在免疫印跡法測定ANA譜中，篩查抗nRNP/Sm、抗Sm、抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B、抗Scl-70、抗PM-Scl、抗Jo-1、抗CENP B、抗PCNA、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白、抗核糖體P蛋白和抗AMA-M2抗體。試劑盒均購自德國歐蒙公司，嚴格按照試劑說明書操作。

1.3 統計學方法

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。首先將ANA抗體譜中定性指標轉化為數值，陽性為1，陰性為0，然后采用聚類法進行分類，Mean法驗證冰柱圖分類的顯著性。呈正態分布的數據采用±s表示，多組間比較采用方差分析和LSD檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 ANA譜陽性率分析

164例ANA斑點型陽性者經聚類法分類并檢驗后最終分為3類：A類（120例）以抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B的高陽性率為特征，B類（21例）以抗U1-RNP的高陽性率為特征，C類（23例）以抗Sm、抗核糖體P蛋白、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白的高陽性率為特征。見表1。

2.2 A類、B類和C類患者所患疾病的分布

與A類、B類和C類最相關的疾病分別是SS、MCTD和SLE。SS患者多表現為A類，即以抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B抗體陽性為主，差異有統計學意義（χ2=16.38，P＜0.01）；MCTD患者多表現為B類，即以抗U1-RNP抗體陽性為主，差異有統計學意義（χ2=62.59，P＜0.01）；SLE患者多表現為C類，即以抗Sm、抗核糖體P蛋白、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白抗體陽性為主，差異有統計學意義（χ2=59.11，P＜0.01）。見表2。

2.3 A類、B類和C類患者實驗室指標的比較

B類患者抗CCP抗體陽性率顯著高于A類和C類患者（P＜0.01）。C類患者Cr、IgG、GLB高于A類和B類患者，而WBC則低于A類和B類患者（P＜0.01）。其他各項指標各組間差異均無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表1 A類、B類和C類患者ANA譜陽性率的比較 [例（%）]

表3 A類、B類和C類患者實驗室指標的比較

3 討論

AID是一種自身免疫細胞、因子過度活化，自身抗體大量產生造成的多器官廣泛損傷的慢性疾病，近年來其發病率呈逐步上升趨勢[6]。作為AID診斷5個依據之一的血清ANA也逐漸受到臨床的關注[7]。聚類分析能通過離差平方和法將同質的疾病或患者群進行歸類分析，以便于后續的觀察，特別適合于臨床表現復雜、自身抗體表現眾多的AID。

斑點型又稱為核顆粒型、核斑塊型。分裂期細胞核質染色呈斑點型、斑塊狀，核仁陰性，分裂期細胞染色質陰性。根據相關文獻報道，斑點型是ANA眾多熒光模型中陽性率最高的[8]。本研究結果顯示，對ANA陽性者進行聚類分析后發現能初步分為高抗SS-A、抗Ro-52、抗SS-B類，高抗U1-RNP類和高抗Sm、抗核糖體P蛋白、抗ds-DNA、抗核小體、抗組蛋白類。這3類人群中的主要代表性疾病分別為SS、MCTD、SLE。這提示檢測ANA譜組合有助于臨床對AID的診斷和鑒別診斷。另外，利用自身抗體的出現可能早于（甚至提前10年）臨床癥狀的出現和發病這一特點，可以有針對性地預測相應疾病[9]。RF不能用聚類分析的方法獲得特征性的抗體組合，這可能與RF既能單獨又能伴隨其他AID發生有關[10]。

本研究結果顯示，B類患者抗CCP抗體陽性率明顯高于A類和C類患者。這可能是由于抗CCP抗體是RA的血清標志物，而MCTD是一種同時或不同時具有SLE、多發性肌炎、硬皮病、RA等疾病混和表現的疾病，不少患者存在與RA類似的關節骨質破壞的癥狀，所以抗CCP抗體在MCTD患者中有較高的陽性率，與文獻報道[11]一致。同時還提示抗CCP抗體可能有助于SS、MCTD、SLE的鑒別診斷。本研究結果還顯示，C類患者存在低水平的WBC和高水平的IgG、Cr，提示這類SLE高發人群可能存在較高風險的腎和血液系統損傷[17]，需進行針對性治療，防止進一步惡化為尿毒癥或造血危象。同時，C類患者高GLB水平提示體內可能存在廣泛的免疫系統紊亂，并通過免疫復合物等途徑誘導炎癥，造成多器官、多系統損傷[13]。

綜上所述，對ANA斑點型陽性者進行血清ANA的譜聚類分析研究有助于臨床提高AID的檢出率并給予及時的對癥治療。