陜西榆林東方蜜蜂微衛星DNA種群遺傳分析

陳道印 劉新宇 高寶國 周姝婧 朱翔杰 徐新建 郝璐楠 周冰峰

（1 福建農林大學蜂學學院，福州 350002；2 陜西榆林市草原工作站，榆林 719000；3 陜西榆林市種蜂場，榆林 719000）

蜜蜂是自然界以及農業生產中非常重要的授粉昆蟲，具有重大的生態價值和經濟價值[1-3]。榆林市位于我國陜西省北部，屬于典型的黃土高原地貌，是我國重要的刺槐、棗花以及蕎麥蜜源區[4]。上世紀80年代，全國東方蜜蜂資源調查顯示我國東方蜜蜂在陜西省北部主要分布于長城以南，榆林市是東方蜜蜂分布的邊緣區之一[5]。我們曾利用10個微衛星位點對榆林市的靖邊、子洲東方蜜蜂進行遺傳分析，研究分布邊緣區域東方蜜蜂的遺傳多樣性和遺傳分化，發現靖邊的東方蜜蜂與黃土高原其他地區存在種群遺傳分化，靖邊、子洲的東方蜜蜂微衛星遺傳多樣性水平低于黃土高原其他地區[6]。靖邊東方蜜蜂曾于2009年8月初爆發蜜蜂大量死亡事件[7,8]，靖邊蜂農所飼養的東方蜜蜂中有近半蜂群死亡[8]，種群數量的下降往往會帶來遺傳多樣性的喪失，威脅種群的生存。

微衛星標記（microsatellite）又被稱為簡單重復序列（SSR），因其具有數量多、變異豐富、容易檢測等特點[9]，已被廣泛應用于種群遺傳研究。前人應用微衛星遺傳標記對秦巴山區[10]、長白山[11]、黃土高原[6]、海南[12]、浙江[13]等地區的東方蜜蜂進行了種群遺傳分化和遺傳多樣性研究。以前由于受分子生物學實驗技術的限制，東方蜜蜂微衛星種群遺傳分析所使用的微衛星位點較少，只有5～10個。隨著分子生物學實驗技術的發展，增加微衛星位點數量對研究東方蜜蜂種群遺傳既可行也必要。

本文利用38個微衛星遺傳標記對陜西省榆林市東方蜜蜂進行種群遺傳分析，評估遺傳多樣性水平。探索分布在邊緣區域的東方蜜蜂在黃土高原生境條件下的遺傳分化規律和遺傳多樣性科學規律，為榆林東方蜜蜂遺傳資源的保護和利用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

2017年采集榆林市共7個樣點，390群東方蜜蜂（圖1）。神木是我們采集的最北部樣點，只采集到5群蜜蜂的樣本，均為野生蜂群。其余6個樣點采自不受人為選育影響的原始飼養蜂群，樣本量分別為榆陽43群，佳縣66群，吳堡31群，綏德83群，清澗79群，靖邊83群。

圖1 榆林市各樣點分布示意圖

1.2 DNA提取與目標片段擴增

每個蜂群提取1只工蜂的基因組，使用Ezup柱式基因組提取試劑盒［生工生物工程（上海）股份有限公司］，每個樣本均使用38對SSR引物（Ac-2、Ac-5、Ac-26、Ap085、AT101、Ac045、K1458、AT165、UN117、AP208、SV039、BI314、K0715、SV220、AP243、BI278、AP066、SV066、AP148、AP042、AT109、BI216、SV261、AT185、AP249、AC139、UN373、AC011、AT103、AP189、UNEV2、BI225、UN270、244T、Ap313、Ac-1、Ac-35、AT004）進行PCR擴增[14,15]。PCR產物經ABI 3730xl自動測序儀進行基因分型與測序，獲得SSR基因型數據。

1.3 數據分析

評估2017年所采集樣本的遺傳分化狀況：Genepop on web分析2017年新采集的各樣點之間的遺傳分化系數（Fst）[16]，并基于Fst計算基因流參數Nm，Nm=1/4（1/Fst-1）[17]；Structure 2.3.4進行遺傳結構分析[18]，生成的結果借助Structure hawester計算最佳分化K值；使用R 3.3.2軟件包使用樣點作為先驗分組進行主成分判別分析（DAPC）驗證分化結果[19]。

評估所采集的所有樣本的種群遺傳多樣性水平：Excel Micro-Satellite Toolkit 3.1進行雜合度（He，Ho）、等位基因數（Na）以及多態信息含量（PIC）的計算[20]；PopGene 1.31軟件進行有效等位基因數（Ne）、香農指數（I）的計算[21]；Fstat 3.2軟件計算等位基因豐富度（Rs）與近交固定系數（Fis）[22]。

統計所有樣本的遺傳結構：GenAlex 6.503進行等位基因型以及等位基因頻率的統計[23]，神木樣點由于樣本數量過少并未納入統計。

2 結果

2.1 榆林東方蜜蜂遺傳分化

根據樣點間的遺傳分化系數、Structure分析、DAPC分析等研究，發現榆林東方蜜蜂分化為3個種群，分別為靖邊種群、綏德-清澗種群以及佳縣-吳堡-榆陽-神木種群。

在Structure分析中，最佳K值為3（圖2），靖邊樣點為獨立的一個分組，綏德、清澗被分為一組，神木、榆陽、佳縣、吳堡4個樣點被分為一組（圖3）。

圖2 榆林東方蜜蜂Structure最佳分組ΔK曲線圖

圖3 榆林東方蜜蜂微衛星遺傳結構

圖4 基于38個微衛星位點的榆林東方蜜蜂DAPC結果圖

使用DAPC分析按樣點進行分組檢驗，結果顯示靖邊為獨立的一組，佳縣-吳堡-榆陽-神木為一組，綏德-清澗完全重疊為一組（圖4）。

遺傳分化系數（Fst）以及基因流（Nm）的分析結果（表1）表明，靖邊與神木、榆陽、佳縣、吳堡之間的Fst在0.0539～0.1083之間。根據Wright所提出的當Fst＞0.05時表明兩個種群存在遺傳分化的標準[24]，靖邊與神木、榆陽、佳縣、吳堡之間存在著明顯的分化。

2.2 榆林東方蜜蜂的遺傳多樣性

遺傳多樣性參數分析顯示榆林東方蜜蜂南部樣點的遺傳多樣性普遍高于北部樣點，分布于榆林東部的6個樣點在期望雜合度（He）上由南到北逐漸降低，而位于南部種群的綏德、清澗樣點在有效等位基因數量（Ne）、香農指數（I）、等位基因豐富度（Rs）以及多態信息含量（PIC）上要明顯高于北部種群各個樣點。

比較該區域各樣點的觀察雜合度（Ho）與期望雜合度（He），綏德、清澗、靖邊、吳堡以及榆陽5個樣點的觀察雜合度（Ho）低于期望雜合度（He），近交系數（F-is）均大于0。

2.3 榆林東方蜜蜂的微衛星遺傳結構

榆林市各個種群的東方蜜蜂在9個微衛星位點上表現出不同的遺傳結構。在位點Ap085上，佳縣與吳堡樣點主要以a187（0.389～0.409）為優勢等位基因，而其他樣點等位基因分布較為分散。在位點AT101上，佳縣、吳堡與榆陽以a246（0.5～0.583）為優勢等位基因，靖邊、綏德、清澗則以a244（0.259～0.462）、a245（0.231～0.398）為優勢等位基因。在位點AC045上，綏德、清澗擁有相對較高的a142比例（0.120～0.175）。在位點AP243中，佳縣、吳堡、榆陽以a257為優勢等位基因（0.326～0.492），其余樣點的等位基因比較分散并無優勢等位基因。在SV066中，靖邊的a185占比在0.97左右，其余樣點則擁有相對較高的a180比例（0.105～0.241）。在位點AP042中，綏德、清澗的a139（0.095～0.211）擁有相對較高的頻率，其余樣點幾乎僅以a143為唯一等位基因。在位點AC011中，榆陽、佳縣、吳堡擁有相對較低的a134（0～0.038），其余樣點的a134在0.108～0.171之間。在位點AP189中，靖邊以a120（0.367）、a122（0.349）為優勢等位基因，其余樣點則以a118（0.339～0.535）為優勢等位基因。在位點244T中，靖邊主要以a189（0.228）、a197（0.321）為優勢等位基因，其余樣點則以a189（0.171～0.417）、a191（0.169～0.317）、a193（0.037～0.274）為優勢等位基因（表3）。

表1 榆林東方蜜蜂遺傳分化系數與基因流

表2 榆林東方蜜蜂遺傳多樣性水平參數信息

表3 榆林東方蜜蜂樣點之間存在差異位點的等位基因頻率表

3 討論

3.1 榆林東方蜜蜂的遺傳多樣性水平

遺傳多樣性是物種進化的基礎[25]，因此遺傳多樣性評估對于遺傳資源的鑒定以及保護有著非常重要的意義。榆林市南部東方蜜蜂種群的遺傳多樣性普遍高于北部種群的多樣性水平。利用本研究與其他研究中相同的8個SSR位點（Ac1、Ac2、Ac5、Ac26、Ac35、Ap085、A313、AT101）進行期望雜合度的計算與比對，海南的平均期望雜合度為0.5970[12]，黃土高原其他樣點的平均期望雜合度為0.6781[6]，秦巴山區的平均期望雜合度為0.6877[10]，榆林市的平均期望雜合度為0.6297，表明榆林市東方蜜蜂遺傳多樣性水平在黃土高原較低，也低于秦巴山區東方蜜蜂的遺傳多樣性水平。

榆林市植被分布由南到北逐漸稀疏，僅于部分溝壑中可能存在有樹洞的喬木，這意味著榆林野生東方蜜蜂的營巢條件受到限制，影響當地東方蜜蜂的自然種群數量，使得榆林東方蜜蜂的遺傳多樣性呈現較低水平。生境破碎化造成東方蜜蜂分布的破碎化，影響各種群間的基因交流，使種群內的東方蜜蜂存在一定程度的近交現象，喪失部分遺傳多樣性。有觀點認為中蜂囊狀幼蟲病能夠導致東方蜜蜂在某些位點上的等位基因大量丟失，造成遺傳多樣性的降低[10]。據采樣時了解到，榆林市部分縣市曾爆發中蜂囊狀幼蟲病，這可能也是造成榆林市東方蜜蜂種群遺傳多樣性較低的原因之一。

3.2 榆林東方蜜蜂的遺傳分化機制

榆林市屬于典型的黃土高原地貌，氣候干燥，植被稀疏，生態環境極為脆弱[26]，境內生境破碎化嚴重[27]。生境破碎影響種群分布，阻礙種群間基因流，促使種群發生分化[28]。榆林所發現的3個種群之間直線距離均在30km以上，蜜蜂最遠的婚飛距離是15km[29]，而各個種群之間缺乏野生東方蜜蜂營巢條件，也沒有蜂場，從而限制了各個種群之間東方蜜蜂的遷移，從而阻斷了種群間的基因流，造成各個種群間發生種群遺傳分化。