阪崎腸桿菌培養上清蛋白引起HepG2肝細胞的基因表達變化

由淑萍 任立松 馬 龍 賀 筍陳澤良王 嶸 劉 濤*

（1．新疆醫科大學公共衛生學院，新疆 烏魯木齊 830011；2．新疆天康畜牧生物技術股份有限公司，新疆 烏 魯木齊 830032；3．中國解放軍69337部隊，新疆 額 敏 834601；4．新疆醫科大學護理學院，新疆 烏 魯木齊 830011）

自Franklin[1]首次分離并報道以來，阪崎腸桿菌(Cronobacter sakazakii)已經多次引起重大食品安全事件，造成嚴重的后果[2-3]。2007年新疆地區在進出口食品中檢測并分離到阪崎腸桿菌[4]。課題組在前期研究中發現阪崎腸桿菌新疆分離株經酪蛋白氨基酸酵母浸膏培養液(casamino acid yeast extract medium，CAYE)培養后，其純化上清蛋白在一定條件下能夠對乳鼠各組織器官產生損傷，尤其對肝組織損傷較為嚴重[5-7]，為進一步探索該上清蛋白損傷肝組織的分子機制，本課題組純化阪崎腸桿菌培養上清蛋白，將上清蛋白加入HepG2肝細胞培養液中，8 h后收集細胞并采用高通量測序法對實驗組及對照組細胞基因進行檢測，分析不同組中基因的差異表達、轉錄本水平定量分析、GO功能富集分析、KEGG通路富集分析，并對RPS18、RFC4基因進行熒光定量PCR驗證，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞

阪崎腸桿菌新疆分離株IQCC10418，由中國檢驗科學院趙貴明老師惠贈，HepG2細胞購于武漢普諾賽生物公司。

1.2 實驗儀器與試劑

CO2培養箱購于Thermo公司；核酸分析儀購于Biochrom公司；CAYE培養液購于北京陸橋公司，配制按照Quintero-villegas等[8]提供的方法進行，胎牛血清、高糖DMEM培養基、細胞培養6孔板購于Gibco公司，Trizol試劑購于Qiagen公司，實時熒光定量儀Light Cycler 2.0購于美國Roche羅氏公司，BCA蛋白質定量檢測試劑盒購于Sangon Biotech公司。

1.3 方法

1.3.1 阪崎腸桿菌培養液上清蛋白純化 采用CAYE培養基于CO2培養箱中37 ℃條件下培養阪崎腸桿菌；12 000 g、4 ℃離心CAYE培養液5 min；0.45 μm膜過濾上清，根據濾過后上清液的體積，按照1∶1比例加入飽合硫酸銨液并攪拌30 m in；12 0 00 g 、4 ℃ 再次進行離心，取沉淀；磷酸鹽緩沖液(pH=7.0)懸浮，4 ℃ 透析。

1.3.2 蛋白質濃度測定 BCA蛋白質定量試劑盒檢測純化產物中蛋白質濃度，用蒸餾水稀釋為含蛋白濃度為1.6 μg/mL的水溶液。

1.3.3 感染HepG2肝細胞、提取總RNA 含10%胎牛血清的DMEM(高糖)完全培養液培養HepG2細胞至長滿培養瓶，細胞呈單層致密狀時，常規胰蛋白酶消化傳代，24 h換液，72 h再傳代；實驗調整HepG2細胞濃度至1×106/mL，于6孔培養板中分別加入1 000 μL蒸餾水及1 000 μL純化產物稀釋液(終濃度為1.6 μg/mL)，建立對照組與實驗組，每組3個復孔，8 h后，加胰酶回收；采用Trizol試劑盒提取總RNA；瓊脂糖凝膠電泳分析樣品RNA完整性及是否存在DNA污染；并檢測RNA純度[D(260)/D (280)比值]。

1.3.4 cDNA文庫構建及高通量測序 用M-MLV逆轉錄酶和隨機引物合成第一鏈cDNA，用DNA聚合酶合成第二鏈cDNA，送Novogene公司illumina芯片測序平臺進行高通量測序，采用GoMiner數據庫進行Gene Ontology(GO)富集分析，采用KEGG數據庫進行Pathway分 析。

1.3.5 差異表達基因分析 采用DESeq2軟件統計比較實驗組和對照組的cDNA文庫，RNA-seq測序技術進行差異顯著性分析，本實驗中兩組間轉錄本的log2(Fold Change)絕對值大于1作為差異顯著性標準。

1.3.6 實時熒光定量PCR 由于高通量測試結果信息量巨大，只能提供初步篩選結果，不能十分準確分析單個基因的狀態及表達情況。因此進行進一步實時熒光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)驗證十分必要。本次我們將選取log2(Fold Change)值為-1.10 且與核糖體密切相關、調節因子發揮重要作用的RPS18基因(ribosomal protein S18)和log2(Fold Change)值為2.13且與調控DNA復制與修復的功能分子RFC (replication factor C)亞基4進行驗證。β-actin為內參基因。RPS18基因(引物序列5′-3′)：P1，tggatcactcggataaatgcggtaact；P2， tggatcactcggataaatgcggtaact(GenBank登 錄 號AY75781.1)。 RFC4基 因 ： P1， ggaactggaaaaacatcca ctattttg； P2， ctgagcagctgaggtcatagaatctgc(GenBank登 錄號CR536561.1)。反應體系共20 μL，Platinum?SYBR?Green qPCR SuperMix-UDG 10 μL，上游引物(10 μmol/L)0.4 μL，下游引物(10 μmol/L) 0.4 μL，模板 2 μL，純水7.2 μL。反應參數為：95 ℃、15 s，95 ℃、10 s，55℃、10 s，50個循環。

2 結果

2.1 總RNA提取結果

瓊脂糖電泳結果表明，提取的RNA無DNA污染。經檢測各組的D(260)/D(280)的值均在1.8～2.0之間，表明提取的總RNA純度符合實驗要求。

2.2 差異表達基因

經高通量測序及基因差異表達結果分析表明，與對照組比較，共有5 120個差異表達基因，其中2 155個上調，2 965個下調。長鏈非編碼RNA(lncRNA)為226個，占差異表達基因總數的4.41%，說明差異表達基因中非編碼序列較少。表1為前5位表達上調的基因，表2為前5位表達下調的基因。

表1 前5位表達上調的基因

表2 前5位表達下調的基因

2.3 差異表達基因涉及到的信號通路

GO和KEGG pathway分析表明，經上清蛋白作用后，基因差異表達涉及到219個信號通路，GO富集分析顯示，差異基因主要參與核分裂、有絲分裂、復制等多個生物學過程(見圖1)。Pathway分析顯示，具有顯著富集的信號通路有5個，差異基因主要參與DNA的復制、蛋白轉運、精氨酸和脯氨酸代謝等(見表3)。

圖1 GO富集分析結果

表3 基因差異表達參與的信號通路

2.4 qPCR驗證結果

qPCR結果見圖2和圖3，可見選取的RPS18、RFC4 mRNA檢測結果與高通量測序的結果相同。與對照組比較，實驗組RPS18 mRNA表達呈現明顯下降趨勢，RFC4 mRNA表達則顯著上升，差異具有統計學意義(P＜0.05)。

3 討論

目前，國內外對于阪崎腸桿菌的污染途徑、致病因子、致病機理等報道非常有限。2003年，Pagotto[9]首次描述了某種類腸毒素化合物可能是阪崎腸桿菌產生的一種毒力因子。阪崎腸桿菌在培養過程中產生的腸毒素是其致病的重要因素，侵入腦微血管上皮細胞后，其外膜蛋白A和外膜蛋白X能夠穿過血腦屏障，并存在于腦巨噬細胞中影響細胞因子的分泌，導致嚴重的大腦疾病，如新生兒腦膜炎、腦梗塞、腦囊腫等，是阪崎腸桿菌的重要致病因子[10-13]。本研究室在對阪崎腸桿菌新疆株的研究過程中發現，編號為IQCC 10418號菌株在經CAYE培養后，其培養上清中產生某種活性蛋白[14]能夠對機體產生損傷，推測可能與阪崎腸桿菌致病有關。

圖2 兩組HepG2細胞中RPS18 mRNA檢測結果分析

圖3 兩組HepG2細胞中RFC4 mRNA檢測結果分析

本研究發現阪崎腸桿菌培養上清蛋白侵襲HepG2肝細胞，通過提取總RNA、反轉錄、高通量測序，異常表達基因有5 120個，包括2 155個表達上調基因，2 965個表達下調基因。CA9基因表達量較高，CA9基因編碼碳酸酐酶蛋白，是鋅金屬酶家族中一員，與機體的鈣代謝、酸平衡等有關；差異表達下調明顯的ACP1基因，編碼Acid phosphatase 1蛋白，該蛋白屬于磷酸酪氨酸蛋白家族成員之一，與酪氨酸代謝相關。還有部分差異表達基因如CALR基因、TMEM 基因等編碼的蛋白涉及細胞的一些重要功能，如信號轉導、鈣代謝等功能[15]。

在差異基因的GO富集和pathway分析[16-18]中還發現，差異表達基因參與了219個信號通路，阪崎腸桿菌侵襲HepG2肝細胞后，其差異基因的表達多為染色體、著絲粒、核糖體等變化，核糖體可從轉錄和翻譯兩個水平上調節相關基因表達，從而調控微生物的次級代謝，同時，核糖體結構改變，其代謝產物合成的調控系統也會出現變化，誘導真核細胞結構變化及有絲分裂[19-20]；在差異表達基因的信號通路中，同樣涉及DNA的復制、蛋白轉運、精氨酸和脯氨酸代謝等多種通路，其中參與差異表達基因最多為Ribosome(hsa03010)，與蛋白的翻譯、轉運等功能相關，參與DNA的修復，調控細胞增殖、凋亡和分化。

進一步進行結果驗證表明，RPS18是由RPS18基因編碼的一種蛋白，參與組成核糖體的40S小亞基，通過與起始因子以及其他核糖體蛋白相互作用，在翻譯起始過程中作為一種調節因子發揮重要的作用。此外，RPS18核糖體蛋白是一種公認的Ca2+/鈣調蛋白激活的蛋白激酶II底物。研究表明，RPS18參與了阪崎腸桿菌培養上清蛋白引起的HepG2肝細胞的病變，能夠調節HepG2肝細胞的毒力和致病力，參與了信號轉導過程。復制因子C(replication Factor C，RFC)是與DNA復制和修復過程密切相關的蛋白，RFC在ATP存在的情況下，能將PCNA和DNA聚合酶δ裝配到附有引物的模板上，從而有效的延伸DNA復制鏈；而RFC4基因對抗DNA復制損傷修復能力具有重要的調控作用，如RFC4等基因下調可減緩肝癌細胞的增殖[21]。研究表明，RFC4基因上調，參與了DNA復制的過程，導致了阪崎腸桿菌培養上清蛋白引起的HepG2肝細胞病變的發生。

綜上，從阪崎腸桿菌培養上清中分離純化的蛋白質，可產生HepG2肝細胞病變，推測該蛋白質的生物活性可能與RPS18、RFC4基因等差異表達，引起的核糖體、染色體、著絲粒等的變化相關，參與DNA的復制與修復、蛋白轉運、精氨酸和脯氨酸代謝等多條信號通路。