協(xié)同刺激分子B7-H4在小鼠食管癌前病變中的表達(dá)

陳欣然，單保恩*

（1．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石 家莊 050011；2．河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院科研中心，河北 石 家莊 050011）

食管癌是常見的消化道腫瘤，其全世界發(fā)病率和病死率分別居癌癥的第8位和第6位[1]。根據(jù)組織類型的不同，食管癌分為食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squmous cell carcinoma，ESCC)和食管腺癌[2]。中國食管癌發(fā)病率居世界第一，其死亡人數(shù)占全球該病死亡人數(shù)的50%以上，平均死亡率為15.02/10萬[3]。另外，中國食管癌發(fā)病率具有明顯的區(qū)域高發(fā)性，河北和河南太行山兩側(cè)區(qū)域是主要的高發(fā)區(qū)，且95%以上為ESCC[4]。ESCC的特點(diǎn)是早期無明顯癥狀，因此癌癥早期確診比例不足5%，絕大多數(shù)患者確診時(shí)已是中晚期。手術(shù)和放化療是ESCC的主要治療手段，但由于ESCC中晚期腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移，治療效果和預(yù)后較差，5年生存率不足20%[5]。

食管癌前病變是正常食管組織向ESCC轉(zhuǎn)變過程中的一種組織病理異常。根據(jù)病變程度的不同，癌前病變可分為低級別上皮內(nèi)瘤變(low grade intraepithelial neoplasia，LGIN)和高級別上皮內(nèi)瘤變(high grade intraepithelial neoplasia，HGIN)[6]。食管癌前病變包括了ESCC形成的整個(gè)過程，但尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移。因此如果在食管癌前病變階段給予恰當(dāng)?shù)脑\斷和治療，治療效果顯著提高。

亞硝胺是一類作用廣泛的致癌物，其前體物硝酸鹽、亞硝酸鹽和二級胺廣泛分布于自然環(huán)境中。流行病學(xué)研究顯示，亞硝酸及硝酸鹽的高攝入是ESCC的重要病因。世界范圍內(nèi)食管癌高發(fā)區(qū)飲水中硝酸鹽含量顯著高于低發(fā)區(qū)[7]。我國ESCC高發(fā)區(qū)，特別是涉縣、赤城縣的飲水中，硝酸鹽、亞硝酸鹽和二級胺的含量顯著高于其他地區(qū)，且與當(dāng)?shù)鼐用馝SCC和食管癌前病變的患病率呈正相關(guān)[8]。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)是一種水溶性喹啉衍生物，化合物中含有硝酸氮，是一種誘癌的亞硝胺前體物[9]。小鼠食管癌前病變的病變進(jìn)程和病理特征與人無明顯差異[10]，本研究中，我們利用4NQO飲水法誘導(dǎo)了小鼠ESCC癌前病變模型。我們發(fā)現(xiàn)，此模型很好地模擬了人ESCC形成過程，可以通過該模型研究ESCC形成的分子機(jī)制。

B7-H4，又稱B7s1或B7x[11]，是B7家族中成員，于2003年被3個(gè)實(shí)驗(yàn)室同時(shí)發(fā)現(xiàn)。B7-H4蛋白在正常組織中表達(dá)呈陰性，但在許多惡性腫瘤組織中高表達(dá)，如肺癌[12]、 卵巢癌[13]、 前列腺癌[14]、 黑色素瘤[15]、胃癌和乳腺癌[16]，且與腫瘤的惡性程度和不良預(yù)后呈正相關(guān)。B7-H4在細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核和血清中均有分布[17]。細(xì)胞膜B7-H4主要在腫瘤的免疫逃逸中發(fā)揮作用，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核B7-H4則主要參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程。然而，目前還未見關(guān)于B7-H4在食管癌前病變進(jìn)程中的報(bào)道。

鱗狀細(xì)胞癌相關(guān)抗原(squamous cell carcinoma associated antigen，SCCA)是從宮頸鱗癌組織中分離的一組腫瘤相關(guān)性糖蛋白。研究發(fā)現(xiàn)SCCA-2在食管癌組織有選擇性表達(dá)，外周血SCCA表達(dá)與ESCC的腫瘤分期和病變長度呈正相關(guān)，其含量變化反映了ESCC病變的進(jìn)展情況，可以作為食管腫瘤的輔助診斷和判斷疾病發(fā)展的一個(gè)重要依據(jù)[18]。本文通過研究B7-H4在食管癌前病變的小鼠食管組織的表達(dá)特點(diǎn)，比較在食管癌前病變進(jìn)程中B7-H4和SCCA-2的表達(dá)差異，分析其臨床意義，探討其作為食管癌前病變生物標(biāo)志的可能性，為ESCC的早期診斷和治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和實(shí)驗(yàn)試劑

4NQO，購于美國Sigma公司；BCA蛋白定量試劑盒，購于上海捷瑞生物科技公司；兔抗人B7-H4單抗，購于美國GeneTex公司；兔抗人β-actin單抗，購于美國Rockland公司；羊抗兔熒光二抗，辣根過氧化物酶羊抗兔二抗，購于美國Sant Cruz公司；Western blot信號增強(qiáng)試劑盒，購于美國Thermo公司；SCCA-2 ELISA試劑盒，購于上海Blue Gene生物科技公司。C57BL/6小鼠，5～6周齡，雌雄各半，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號：114007000035608。動(dòng)物飼養(yǎng)于SPF環(huán)境，溫度18～24 ℃，濕度40%～60%，照明按12 h/12 h明暗交替。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均符合河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物福利指導(dǎo)原則標(biāo)準(zhǔn)。臨用前將4NQO粉末溶于滅菌的蒸餾水中并稀釋至50 μg/mL。

1.2 模型建立

133只C57BL/6小鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為空白對照組(n=42)和4NQO誘癌組(n=91)。實(shí)驗(yàn)持續(xù)28周。空白對照組28周內(nèi)均給予無菌蒸餾水；4NQO誘癌組在第1～15周給予50 μg/mL的4NQO，第16～28周給予無菌蒸餾水。從第16～28周，每兩周處死一批動(dòng)物，包括6只空白對照組和13只4NQO誘癌組小鼠。誘癌及實(shí)驗(yàn)操作流程參見圖1。

1.3 標(biāo)本收集

將小鼠摘眼球取血，室溫放置10 min，4 000 r/min離心10 min，分離血清。脫頸椎處死動(dòng)物，暴露胸腔和腹腔，分離食管組織，用生理鹽水清洗殘余血液后，縱向剖開，然后從賁門端向舌端卷成多層圓筒形，并用大頭針固定。將固定好的食管組織放入4%多聚甲醛中固定72 h，石蠟包埋，之后切成4 μm連續(xù)切片，用于HE染色評價(jià)。

圖1 4NQO誘導(dǎo)小鼠食管癌前病變模型圖

1.4 HE染色

取組織標(biāo)本，經(jīng)95%乙醇溶液和二甲苯脫水透明后，石蠟包埋。自動(dòng)切片機(jī)切成3 μm厚的切片，經(jīng)二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化后進(jìn)行HE染色，中性樹膠封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察食管組織的病理變化，中性樹膠封固。

1.5 免疫組織化學(xué)染色分析B7-H4的表達(dá)

將切片置于60 ℃恒溫箱干烤過夜，經(jīng)過乙醇梯度脫水，二甲苯透明和3%的過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶20 min，高壓熱修復(fù)后，PBS清洗切片，滴加兔抗人B7-H4單克隆抗體(1∶500稀釋)，4 ℃孵育過夜。PBS清洗后滴加牛血清白蛋白封閉液，37 ℃封閉45 min。PBS清洗后，滴加辣根過氧化物酶羊抗兔二抗，37 ℃孵育60 min。PBS清洗，DAB顯色劑顯色，中性樹膠封固。

免疫組織化學(xué)檢測結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師獨(dú)立雙盲評估。光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)高倍(×400)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)上皮細(xì)胞。在細(xì)胞質(zhì)和(或)細(xì)胞膜上有棕黃色顆粒的視為陽性表達(dá)細(xì)胞。B7-H4表達(dá)水平評分標(biāo)準(zhǔn)：①陽性細(xì)胞比例得分，陽性細(xì)胞≤33%為1分，＞33%～66%為2分，＞66%為3分；②染色強(qiáng)度得分，無著色或淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。結(jié)果判斷：兩者相乘為最終得分，其中得分≤3分判定為B7-H4低表達(dá)組，得分＞3分判定為B7-H4高表達(dá)組[19]。

1.6 Western blot法檢測血清B7-H4蛋白表達(dá)

取血清，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量，然后用生理鹽水將血清樣本稀釋至4 μg/μL。稀釋后的血清與上樣緩沖液按3∶1比例混合，100 ℃煮沸5 min變性。每個(gè)樣本取50 μL(150 μg)進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)至轉(zhuǎn)膜結(jié)束[20]。然后按Western blot信號增強(qiáng)劑試劑盒說明書進(jìn)行操作：將膜用超純水洗2次，每次5 min。將膜浸入25 mL信號增強(qiáng)劑，搖床振蕩15 min。再將膜用超純水洗2次，每次5 min。脫脂奶粉封閉60 min后，將膜浸入用抗體稀釋劑稀釋的小鼠抗B7-H4單抗(1∶500)，4℃孵育過夜。TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次，熒光掃描分析。

1.7 ELISA法測定SCCA-2濃度

根據(jù)BCA定量的血清蛋白濃度，用生理鹽水將血清稀釋至5 μg/μL。用純化的抗體包被微孔板，然后加入50 μL標(biāo)準(zhǔn)品或血清樣本，然后依次加入生物素化的抗體、辣根過氧化物酶和標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物TMB顯色。用酶標(biāo)儀在450 nm下測定吸光度，并計(jì)算樣本血清SCCA-2濃度。

1.8 Western blot法檢測食管組織B7-H4蛋白表達(dá)

取食管組織，低溫勻漿，RIPA裂解液提取總蛋白，12 000 r/min低溫離心10 min后，轉(zhuǎn)移上清液至預(yù)冷的新離心管中，用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量[23]。在蛋白樣本中加入上樣緩沖液，置于沸水中煮沸5 min。取適量蛋白進(jìn)行10% SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜上，然后用5%脫脂奶粉室溫條件下封閉60 min，再分別放入β-actin(1∶5 000稀釋)和B7-H4(1∶1 000稀釋)的單克隆抗體中，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次后，加入羊抗兔熒光二抗，37 ℃孵育60 min，TBST洗膜3次，熒光掃描分析。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析均采用Graphpad prism 5.0數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)。定量數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用Spearman correlation analysis比較不同參數(shù)間的相關(guān)性，用Oneway ANOVA，Kruskal-Wallis analysis比較不同指標(biāo)在兩組或多組間的差異。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 誘癌過程中食管組織的病理改變

從誘癌16周至28周，每2周解剖食管組織(圖2)。所有空白對照組小鼠食管組織表面光滑，食管大小粗細(xì)均正常。然而，4NQO誘癌組小鼠食管組織卻表現(xiàn)為不同程度的病理改變。從第16周至28周，食管上皮組織依次出現(xiàn)大小不同的白斑、增厚、凸起及大小不等的腫塊，且與人食管癌前病變組織相似。

HE染色結(jié)果顯示(圖3)，在整個(gè)誘癌過程中，食管組織經(jīng)歷了從正常食管、LGIN至HGIN的病理改變過程。正常食管上皮細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞核和細(xì)胞漿大小正常。LGIN則表現(xiàn)為食管上皮增厚，黏膜層下1/2細(xì)胞失去極性，細(xì)胞核增大，核深染。HGIN則表現(xiàn)為上皮層進(jìn)一步增厚，黏膜層超過1/2至全部細(xì)胞失去極性，細(xì)胞核逐漸增至最大值，核深染。LGIN和HGIN統(tǒng)稱為食管癌前病變，經(jīng)過癌前病變的過程，食管鱗狀細(xì)胞癌形成。從HE染色結(jié)果分析，小鼠食管癌前病變的病理特征與人食管癌前病變特征非常相似[10]。

4NQO誘癌時(shí)間與食管病理變化之間的關(guān)系如表1所示，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)空白對照組小鼠食管組織未出現(xiàn)任何異常病理改變，而4NQO誘癌組小鼠食管組織病理級別隨著誘癌時(shí)間的延長逐漸提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(r=0.55，P＜0.01)。另外，雌性與雄性小鼠食管組織病理改變無顯著差異(P＞0.05)。

綜上所述，4NQO飲水法可成功誘導(dǎo)小鼠食管癌前病變的形成。隨著誘癌時(shí)間的延長，病變級別逐漸提高。

圖2 誘癌過程中食管組織變化

圖3 誘癌過程中食管組織HE染色(×400)

2.2 免疫組化分析食管組織B7-H4表達(dá)及與病理級別的相關(guān)性

結(jié)果如圖4和表2所示，B7-H4蛋白表達(dá)于食管上皮細(xì)胞的胞漿和胞膜。根據(jù)評分結(jié)果(低表達(dá)或高表達(dá))，22例正常食管組織只有2例B7-H4高表達(dá)(9.1%)；對于食管癌前病變組織，27例LGIN食管組織有11例B7-H4高表達(dá)(40.7%)，21例HGIN食管組織有17例B7-H4高表達(dá)(81.0%)。Spearman相關(guān)性分析表明(如表2所示)，B7-H4表達(dá)與病理級別呈正相關(guān)(r=0.57，P＜0.01)，而與小鼠性別無相關(guān)性(r=-0.03，P=0.79)。

表1 小鼠食管癌前病變進(jìn)程中食管組織病理改變

表2 小鼠食管癌前病變進(jìn)程中食管上皮組織B7-H4表達(dá)與組織病理級別的相關(guān)性

圖4 免疫組化檢測食管上皮組織B7-H4表達(dá)

2.3 B7-H4和SCCA-2蛋白在小鼠血清的表達(dá)

ELISA結(jié)果如圖5所示，正常、LGIN、HGIN 小鼠血清SCCA-2濃度分別為(1.97±0.70)、(1.94±0.57)、(2.73±1.17) ng/mL。食管癌前病變小鼠血清中SCCA-2濃度逐漸提高，與正常小鼠相比，HGIN小鼠SCCA-2濃度顯著高于正常對照組(P＜0.01)。

圖5 食管癌前病變進(jìn)程中小鼠血清SCCA-2蛋白表達(dá)

通過Western blot方法檢測血清中B7-H4表達(dá)，結(jié)果如圖6所示。首先進(jìn)樣不同量的血清蛋白(0、50、100、200 μg)，掃描其熒光值，考察實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度和線性。結(jié)果顯示，本方法在進(jìn)樣量0～200 μg，線性良好，r2=0.998，可以滿足實(shí)驗(yàn)要求。然后，根據(jù)HE檢測結(jié)果，選取不同食管病理級別的小鼠血清樣本進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，正常、LGIN、HGIN小鼠血清B7-H4相對表達(dá)濃度分別為0.31±0.62、0.46±0.61、0.87±0.90。與正常小鼠相比，HGIN小鼠血清B7-H4濃度顯著提高(P＜0.05)。

上述結(jié)果表明，與正常小鼠相比，B7-H4和SCCA-2蛋白在HGIN小鼠血清中表達(dá)均顯著提高。上述結(jié)果提示，B7-H4與SCCA-2兩種蛋白均可能成為ESCC及癌前病變的一種新的血清標(biāo)志物，這對于ESCC的早期診斷具有重要意義。

2.4 Western blot蛋白在小鼠食管組織的表達(dá)

結(jié)果如圖7所示，誘癌第16～28周，對照組小鼠食管組織B7-H4表達(dá)無顯著改變。因此，將對照組所有小鼠食管組織B7-H4蛋白表達(dá)的數(shù)據(jù)整合。與對照組比較，隨著誘癌時(shí)間的延長，4NQO誘癌組小鼠食管組織B7-H4蛋白表達(dá)逐漸提高，特別是第26周和28周，B7-H4蛋白表達(dá)水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01)。

綜上所述，小鼠4NQO誘癌模型中，隨著誘癌時(shí)間的延長，食管組織依次出現(xiàn)LGIN和HGIN的癌前病變特征，B7-H4表達(dá)也逐漸上調(diào)。B7-H4在小鼠血清的表達(dá)與食管組織的病理級別呈顯著正相關(guān)。上述結(jié)果提示，B7-H4可能參與了食管癌前病變的進(jìn)程，促進(jìn)了ESCC的形成，但其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

圖6 B7-H4在血清的表達(dá)

圖7 B7-H4在食管組織的表達(dá)

3 討論

目前，腫瘤動(dòng)物模型主要包括自發(fā)性動(dòng)物模型，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，誘發(fā)性動(dòng)物模型和移植性動(dòng)物模型。食管癌前病變模型無自發(fā)性和轉(zhuǎn)基因模型的報(bào)道，目前主要適用誘發(fā)性病變模型。在小鼠誘發(fā)性食管癌及癌前病變模型中，常用的誘癌劑主要有4NQO、甲基芐基亞硝胺和對甲基戊基亞硝胺。甲基芐基亞硝胺和對甲基戊基亞硝胺只能用于大鼠實(shí)驗(yàn)而不能成功誘導(dǎo)小鼠ESCC及癌前病變，應(yīng)用受到一定限制[21]。

雖然Tang和Tsang曾報(bào)道4NQO可誘導(dǎo)小鼠ESCC形成[22]，但對于食管癌前病變尚無詳細(xì)報(bào)道。本研究利用4NQO飲水法成功誘導(dǎo)了食管癌前病變，并詳細(xì)評價(jià)了食管癌前病變進(jìn)程中的病理變化，以及癌前病變的主要特點(diǎn)。在誘癌過程中，我們發(fā)現(xiàn)對照組小鼠食管組織未出現(xiàn)病理變化，而誘癌組第16周食管上皮組織出現(xiàn)白斑，停用誘癌劑后，食管組織病變級別進(jìn)一步提高。HE染色結(jié)果顯示，在整個(gè)誘癌過程中，食管組織經(jīng)歷了從正常食管組織、LGIN至HGIN的病理改變過程。比較小鼠LGIN和HGIN病理特征，與人食管癌前病變特征基本一致[10]。統(tǒng)計(jì)分析表明，4NQO誘癌組小鼠食管組織癌前病變級別與誘癌時(shí)間呈顯著正相關(guān)，也就是說，隨著誘癌時(shí)間的延長，食管組織病變級別逐漸提高。

ELISA和Western blot結(jié)果表明，與正常對照組相比，HGIN小鼠血清B7-H4和SCCA-2表達(dá)都顯著提高，這提示B7-H4與SCCA-2兩種蛋白，可能成為ESCC早期診斷的生物標(biāo)志物。然而，由于兩種蛋白的檢測方法不同，不能對兩種蛋白的表達(dá)進(jìn)行詳細(xì)比較。Western blot方法因?yàn)殪`敏度較低，不是檢測血清蛋白的最佳方法。然而，由于沒有檢測小鼠B7-H4的ELISA試劑盒，也沒有用于進(jìn)行ELISA方法檢測的小鼠B7-H4單克隆抗體，本研究只能用Western blot方法替代。在以后的研究中，我們希望能夠有機(jī)會(huì)利用ELISA的方法更精確的檢測B7-H4在食管癌前病變小鼠血清的表達(dá)變化，為食管癌前病變的血清學(xué)診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)。

利用Western blot方法檢測B7-H4在食管組織的表達(dá)，結(jié)果表明，正常對照組B7-H4表達(dá)較低，且整個(gè)誘癌過程中表達(dá)無明顯變化。與對照組相比，4NQO誘癌組小鼠B7-H4的表達(dá)逐漸提高，誘癌第26和第28周，B7-H4的表達(dá)水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這個(gè)結(jié)果與免疫組化的結(jié)果相互印證，且B7-H4 的表達(dá)與食管組織病理級別和誘癌時(shí)間呈顯著正相關(guān)。這些結(jié)果提示，B7-H4蛋白的表達(dá)可能參與或促進(jìn)了食管癌前病變的形成，但其發(fā)揮的具體作用及作用機(jī)制還不清楚，仍需進(jìn)一步研究。

在以后的研究中，為了更進(jìn)一步明確B7-H4在小鼠食管癌前病變中所起的作用，可以通過轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行誘癌實(shí)驗(yàn)。具體地說，就是通過比較4NQO飲水法誘導(dǎo)B7-H4敲除和B7-H4野生型小鼠食管癌前病變形成的差異，以及在這個(gè)過程中相關(guān)分子表達(dá)變化，進(jìn)一步明確B7-H4參與食管癌前病變形成的作用及分子機(jī)制，從而探討B(tài)7-H4在食管癌前病變診斷和治療中的意義。

總之，本研究利用4NQO飲水法成功建立了小鼠食管癌前病變模型，詳細(xì)研究了食管癌前病變進(jìn)程的病變特征。在食管癌前病變進(jìn)程中，B7-H4在食管組織和血清中表達(dá)均逐漸提高，提示其可能參與或促進(jìn)了ESCC的形成，這為ESCC的早期診斷和治療提供新思路，但作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。