淬滅胃癌SGC-7901細胞內活性氧對維生素E琥珀酸脂誘導內質網應激的影響

黃曉莉，吳 坤，趙莎莎

（1．山東大學齊魯醫院營養科，山東濟南250012；2．哈爾濱醫科大學營養與食品衛生教研室，黑龍江 哈 爾濱 150081）

維生素E琥珀酸酯(vitamin E succinate，VES)是天然維生素E的第6位羥基被琥珀酸所替代，并脫去1個水分子形成的酯類化合物。體內外研究發現VES作為一種潛在的腫瘤化學預防和治療劑，能夠通過死亡受體介導的外源性途徑、線粒體介導的內源性途徑、MAPK、氧化應激等機制誘導不同腫瘤細胞發生凋亡[1-3]。近年來，活性氧(reactive oxygen species，ROS)和內質網應激(endoplasmic reticulum stress，ERS)作為關鍵的信號分子和信號途徑在抗腫瘤研究中越來越受到重視[4-5]。ERS發生時，細胞可通過啟動未折疊蛋白反應來提高自身的生存能力，但是若應激刺激過強或過久，未折疊蛋白反應反而會激活相應的凋亡機制，誘導細胞凋亡[5]。我們前期研究發現VES能夠誘導胃癌SGC-7901細胞發生內質網應激和未折疊蛋白反應，并能夠增加SGC-7901細胞內ROS的含量[3，6-7]。本文擬探討VES處理人胃癌細胞后淬滅ROS對細胞內質網應激的影響，旨在深入闡明VES誘導人胃癌細胞凋亡過程中ROS與內質網應激的關系。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

VES和N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine，NAC)購自Sigma公司；RPMI-1640培養液購自Gibco公司；葡萄糖調節蛋白78 (glucose regulative protein，GRP78)多克隆抗體和C/EBP同源蛋白(C/EBP-homologous protein，CHOP)單克隆抗體均購自Cell Signaling公司；β-actin購自Santa Cruz公司；逆轉錄-PCR試劑盒購自TaKaRa。

MCO-17A型CO培養箱購于Sanyo公司；AllegraTM

2 64R低溫高速離心機和DUR 640核酸蛋白分析儀均購于Beckman公司；C1Si型激光共聚焦顯微鏡購自上海衡橋儀器有限公司；FACScan (Becton Dickinson)型流式細胞儀購于貝克曼庫爾特商貿有限公司；分子雜交箱購于Amersham Life Science；ChemilmagerTM4000數字凝膠成像系統購于Alpha Innotech公司。

1.2 細胞培養與分組

人胃癌SGC-7901細胞購自北京腫瘤研究所，細胞在含有10%小牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素和2 mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI-1640培養液中，于37 ℃、CO2體積分數為5%的培養箱中常規培養。VES溶于無水乙醇中，配制為10 mg/mL的儲備液，4 ℃避光保存。處理細胞時用2% RPMI-1640培養液稀釋成20 μg/mL，含有0.1%乙醇的RPMI- 1640培養液為溶劑對照，并設有VES處理組、NAC處理組和NAC+VES聯合處理組。

1.3 檢測細胞內ROS含量

不同濃度(1、5、10和20 mmol/L)NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理12 h，無血清培養液與2′，7′-二氫二氯熒光黃雙乙酸鈉(2′，7′-dichlorodihydro-fluorescein diacetate， DCFH-DA) 以1∶ 1 000 比例混合，使DCFH-DA終濃度為10 μmol/L。緩慢沖洗細胞后，加入稀釋好的DCFH-DA溶液，37℃培養箱內孵育20 min，每隔5 min輕輕搖勻1次。PBS緩慢沖洗細胞3次后，激光共聚焦顯微鏡檢測熒光強度，發射波長為525 nm，激發波長為488 nm。DCFH-DA進入細胞后生成二氯二氫熒光素(dichlorodihydrofluorescein，DCFH)，細胞內的ROS可以使無熒光的DCFH氧化生成有熒光的二氯熒光黃(diemorofluorescein，DCF)，激光共聚焦顯微鏡觀察可見綠色熒光，ROS含量越高則熒光強度越強。另將20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理細胞12 h，經DCFH-DA染色后，流式細胞術檢測細胞內ROS水平的變化，方法同上。

1.4 逆轉錄PCR(RT-PCR)法檢測mRNA表達

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理15 h后，收集細胞，用Trizol法提取細胞總RNA，按照試劑盒說明書進行逆轉錄。引物序列：β-actin，上游5′-GTGGGCCGCTCTAGGCACCA A-3′，下游5′-CTCTTTGATGTCACGCACGATTTC-3′，擴增產物為540 bp；GRP78，上游5′-GATAATCAACC AACTGTTAC-3′，下游5′-GTATCCTCTTCACCAGTTGG-3′，擴增產物為577 bp；CHOP，上游5′-GCACCT CCCAGAGCCCTCACTCTCC-3′，下游5′-GTCTACTCC AAGCCTTCCCCCTGCG-3′，擴增產物為422 bp。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，36個循環。PCR產物經2%瓊脂糖凝膠電泳及溴化乙啶染色、拍照，并進行灰度值分析。

1.5 Western blot法檢測蛋白表達

20 mmol/L NAC作用胃癌SGC-7901細胞2 h，再加入20 μg/mL VES處理24 h后，收集細胞，用冷的PBS沖洗2次，懸浮于細胞裂解液中，冰上裂解30 min，采用Bio-Rad DC Protein Assay測定上清液中蛋白質含量，等量蛋白上樣，經10%SDS-PAGE凝膠電泳進行蛋白分離，低溫轉移至PVDF膜上，封閉液封閉2 h后，分別加入一抗和堿性磷酸酶標記的IgG二抗，孵育后加顯色底物，數字成像儀掃描成像，并進行灰度值分析。

1.6 統計學方法

每組實驗至少重復3次，采用SPSS 16.0軟件進行數據處理和分析。通過ANOVA方差分析進行組間比較，各組之間的兩兩比較采用LSD法，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 激光共聚焦顯微鏡觀察胃癌SGC-7901細胞ROS水平

激光共聚焦顯微鏡觀察見圖1。結果表明，20 μg/mL VES使細胞內ROS含量明顯升高，而經不同濃度NAC預處理之后，與單純VES處理組相比，10 mmol/L NAC預處理組細胞內ROS開始降低，20 mmol/LNAC預處理組降低最為明顯。

圖1 激光共聚焦顯微鏡觀察SGC-7901細胞內ROS水平

2.2 流式細胞術檢測胃癌SGC-7901細胞內ROS水平

見圖2。結果表明，與對照組比較，20 μg/mL VES明顯促進細胞內ROS的生成，而20 mmol/L NAC預處理能明顯降低ROS的產生，與激光共聚焦顯微鏡檢測的結果一致，差異均具有統計學意義(P均＜0.05)。

圖2 流式細胞術檢測SGC-7901細胞內ROS水平

2.3 淬滅細胞ROS對內質網應激相關分子GRP78和CHOP mRNA表達的影響

見圖3。結果表明，20 μg/mL VES能夠提高GRP78和CHOP mRNA水平，而20 mmol/L NAC顯著抑制VES對GRP78和CHOP mRNA表達的誘導作用。

2.4 淬滅細胞ROS對內質網應激相關分子GRP78和CHOP蛋白表達的影響

見圖4。結果表明，20 μg/mL VES能夠提高胃癌SGC-7901細胞內GRP78和CHOP蛋白水平，而20 mmol/L NAC顯著抑制VES對GRP78和CHOP蛋白表達的誘導作用。

3 討論

內質網作為真核細胞重要的亞細胞器，參與蛋白質的合成、加工、運輸及脂類的合成和儲存等重要生理功能。各種生理和病理刺激條件下，未折疊或折疊錯誤的蛋白積聚在內質網內，可誘發內質網應激反應。如果內質網應激反應損傷嚴重，則激活相應的凋亡機制，誘導細胞發生凋亡[5]。ROS產生增加或抗氧化防御系統受到損傷時，細胞處于氧化應激狀態，也可以引起細胞凋亡[4]。有研究發現內質網應激誘導糖尿病腎病小鼠管狀上皮細胞凋亡過程中，ROS發揮了非常重要的作用[8]。也有報道顯示亞硒酸鈉誘導人急性早幼粒細胞白血病NB4細胞和脫氫甲基還氧醌霉素誘導肝癌細胞發生的內質網應激是氧化應激的下游事件[9-10]。另有研究卻發現葡萄糖誘導的內質網應激并未依賴氧化應激，相關研究結論并不一致[11]。我們前期研究已經發現VES能夠誘導胃癌SGC-7901細胞發生內質網應激和未折疊蛋白反應，并能夠增加SGC-7901細胞內ROS 的含量，本文則探討VES處理人胃癌細胞后淬滅ROS 對內質網應激的影響。

圖3 NAC對內質網應激相關分子mRNA表達的影響及灰度值分析

圖4 NAC對內質網應激相關分子蛋白表達的影響及灰度值分析

NAC作為一種巰醇化合物，是細胞內還原型谷胱甘肽的前體，可以促進谷胱甘肽合成，增強谷胱甘肽S轉移酶的活性，對氧自由基反應直接作用并促進解毒，是一種非常強的抗氧化劑，可以抑制細胞內ROS的產生[12]。本研究中20 μg/mL VES能夠顯著促進胃癌SGC-7901細胞內ROS的生成，20 mmol/L NAC預處理細胞2 h可以明顯抑制ROS的產生，驗證了NAC清除ROS的作用，并通過探討VES處理胃癌細胞后NAC對內質網應激的影響，進而闡明VES誘導人胃癌細胞凋亡過程中ROS與內質網應激的關系。

GRP78分布在內質網腔內，可識別錯誤折疊蛋白，協助蛋白質折疊、伸展、組裝和轉運，幫助未折疊蛋白定位于內質網腔，具有內質網標志性分子伴侶的功能[13]。CHOP是內質網應激特異性轉錄因子。在非應激狀態下，CHOP表達水平很低；發生內質網應激后，CHOP表達水平顯著增加[14]。本研究發現20 μg/mL VES能夠顯著誘導GRP78和CHOP mRNA 及蛋白的表達，與前期結果一致。而通過NAC淬滅胃癌SGC-7901細胞內ROS后，20 μg/mL VES對GRP78和CHOP mRNA及蛋白表達的促進作用均被顯著抑制。因為GRP78和CHOP都是內質網應激非常特異的信號分子，所以本研究結果提示VES誘導的內質網應激可能依賴于ROS的生成。Kadara等[15]同樣發現，維胺脂引起人頭頸癌細胞ROS的形成可以引起內質網應激反應。還有研究發現維生素C和NAC等抗氧化劑能夠抑制牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)引起的腎近端小管上皮細胞GRP78水平上升[16]。同樣也有與本研究結果不同的報道。抗氧化劑維生素C和維生素E并不能逆轉高濃度葡萄糖作用人臍帶上皮細胞引起的內質網應激[17]。本研究僅初步探討VES作用胃癌細胞后淬滅活性氧對內質網應激的影響，詳細的機制仍需要進一步探討。