細顆粒物對斑馬魚胚胎發育的影響

吳德生王宏輝袁建輝 2*王宏菊趙瓊輝劉建軍

（1．深圳市疾病預防控制中心毒理研究所，現代毒理學重點實驗室，廣東 深 圳 518055；2．深圳市南山區疾病預防控制中心，廣東深圳 518054；3．深圳市出入境檢驗檢疫局，廣東 深 圳 518045）

細顆粒物(fine particulate matter，PM2.5)是空氣動力學直徑小于2.5 μm的顆粒，其粒徑小，比表面積大，易于富集空氣中的有毒有害物質，并可以隨著人的呼吸進入體內，甚至進入人體肺泡或血液循環系統，直接導致心血管、呼吸系統等疾病，是大氣環境中化學組成成分最復雜、危害最大的污染物之一[1-2]。當前，PM2.5污染已成為突出的大氣環境問題，引起全世界各國的廣泛關注。

長期處在霧霾天氣中，人體吸入越來越多顆粒物，附于其上的有毒有害物質不斷地隨著血液進入人體，會對雌性或雄性的性腺產生直接或間接的毒性效應，人群中不育、性功能異常、月經周期紊亂等生殖功能發生異常的壓力也隨之增加[3-4]。然而，目前我們對霧霾細顆粒物對胚胎發育的危害作用及其機制并不十分清楚。因此，本文以模式生物斑馬魚胚胎為研究模型，探討霧霾細顆粒物對胚胎發育的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

TH-1000 CII智能大容量空氣細顆粒物(PM2.5)無碳刷采樣器，購于武漢天虹儀表有限責任公司；石英濾膜購于美國Whatman公司；斑馬魚飼養系統購于北京愛生科技發展有限公司，HF212uv CO2培養箱購于上海力新儀器有限公司，體式顯微鏡購自德國Leica顯微系統貿易有限公司。

1.2 斑馬魚

AB系斑馬魚，由深圳市疾病預防控制中心現代毒理學實驗室自有AB系種魚繁殖提供。飼養于斑馬魚飼養系統，光照周期14 h/10 h明暗交替，每天投食1次，挑選體長(3±1) cm的成年、健壯斑馬魚進行實驗。

1.3 斑馬魚胚胎收集

選擇發育良好的5月齡性成熟斑馬魚18尾。雌雄各9尾分別放入3個交配盒，每盒雌雄各3尾，雌魚和雄魚分別置于交配盒隔離板兩側。隔離過夜后，給予光照刺激產卵，同時撤去隔離板，10～30 min后，將成魚轉移回飼養系統，收集交配盒底部胚胎，于培養箱中備用。

1.4 PM2.5樣品采集

選擇霧霾天氣進行采樣，采樣點位于深圳市某小學樓頂無遮擋區域，用細顆粒物采樣器采集大氣細顆粒物。采樣時間為24 h ，連續7 d ，采樣體積為1.3 m3/min。

1.5 PM2.5樣品前處理

將載有顆粒物的濾膜剪裁成2 cm×2 cm，浸入去離子蒸餾水中，超聲振蕩3 次，每次20 min，洗脫顆粒物。振蕩液經6 層紗布過濾，濾液于4 ℃、14 000 r/min 離心30 min (半徑2.5 cm)，收集下層懸液冷凍真空干燥，低溫冰箱保存備用。臨用前用斑馬魚飼養用水配制成相應濃度，振蕩使顆粒物充分混勻。

1.6 斑馬魚胚胎PM2.5暴露

將收集到的240個受精后2 h 的斑馬魚胚胎隨機分為6組，每組40個，分別暴露于0、5、20、80、320、800 μg/mL的PM2.5混懸溶液中，混懸液隨濃度的增加而濁度增加，在暴露后2、4、6、8、16、24、48、72、96 h分別在體式顯微鏡下計數胚胎孵化和死亡情況。

1.7 數據處理

實驗結果以x±s表示。實驗組與對照組間指標差異采用SPSS 19.0軟件單因素方差分析方法處理，以α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 霧霾細顆粒物對斑馬魚死亡率的影響

如圖1所示，與對照組相比，各劑量組在暴露后4 h開始出現胚胎死亡的現象，80、320、800 μg/mL劑量PM2.5混懸溶液組胚胎在暴露后48 h開始出現大量的死亡，320、800 μg/mL組死亡率達到100%。經過統計分析，PM2.5對斑馬魚胚胎的半數致死量為(56.6±2.8)μg/mL。

圖1 霧霾細顆粒物對斑馬魚胚胎發育的影響

2.2 霧霾細顆粒物對斑馬魚胚胎孵化率的影響

如圖2所示，與對照組相比，斑馬魚胚胎在霧霾細顆粒物暴露48 h后，隨著劑量的升高，胚胎孵化率逐漸降低。暴露72 h后，只有對照組孵化率達到100%，而800 μg/mL劑量組無一粒胚胎孵化。

圖2 霧霾細顆粒物對斑馬魚胚胎孵化率的影響

如圖3所示，斑馬魚胚胎通常于受精后48 h左右開始孵化，隨著細顆粒物暴露的濃度增加，胚胎出現不能孵化或者死胎現象也隨之增高，其中80 μg/mL組有較多胚胎出現了不出膜現象。

3 討論

圖3 細顆粒物暴露后斑馬魚胚胎的變化(×30)

2013年1月在霧霾污染最嚴重的京津冀區域共計發生5次強霾污染過程，整個1月份共計22 d PM2.5小時濃度超過國家擬于2016年實施的環境空氣質量標準的二級標準(75 μg/m3)，其中PM2.5最高值一度達到680 μg/m3，遠高于“重度污染”的界限[5]。據遼寧省環保廳發布的數據顯示[6]，2015年11月8日，沈陽市遭遇6級嚴重霧霾污染，全市PM2.5均值一度達到1 155 μg/m3，局地霧霾指數一度突破1 400 μg/m3，居當日中國重點城市空氣污染首位。深圳市2014—2015年間，輕度污染發生天數占比19%。如此多發的霧霾天氣引發了民眾對健康的擔憂，尤其是霧霾對生殖健康的影響也成為民眾關注的焦點之一。

有研究發現。大氣PM2.5污染與人類生殖功能的改變顯著相關。Rogers等[7]的調查顯示極低體質量兒與母親暴露于二氧化硫(sulfur dioxide，SO2)和總懸顆粒物(total suspended particulate，TSP)的量存在明顯的相關性。Dugandzic等[8]發現空氣污染可能會增加新生兒低體質量的風險，這種影響以妊娠第1個月及最后兩周最明顯。PM2.5濃度與嬰兒低出生體質量、宮內發育遲緩(intrauterine growth retardation，IUGR)及先天性功能缺陷具有顯著統計學意義。BELL等[9]分析出生體質量不足(低于2 500 g)的因素表明：孕期暴露于PM2.5中，其濃度每增加1個4分位差(2.2 g/m3)，嬰兒出生體質量就下降14.7 g(95%CI：12.3～17.1 g)。出生體質量不足與中期(14～26周)暴露于PM2.5有關。PM2.5對黑人母親后代的危險性大于白人母親的后代，顯示出明顯的種族效應。Dejmek等[10]對PM2.5濃度較高的波希米亞褐煤盆地的一組孕婦進行研究發現，對于中等濃度的PM2.5暴露孕婦出現IUGR的OR值為1.26(0.81～1.95)，而高濃度(＞37 μg/m3)為2.11(1.20～3.70)，表明中、高濃度的細顆粒物污染可能會影響胚胎發育。

目前，有關PM2.5動物實驗的研究多集中于呼吸系統的危害，較少涉及生殖系統。本研究以斑馬魚為模式生物，研究PM2.5對斑馬魚胚胎發育的影響。正常情況下，斑馬魚胚胎在受精后48 h左右即可開始出膜孵化，以一定濃度PM2.5暴露于受精后的斑馬魚胚胎，其發育受到顯著的影響。本研究中，對照組48 h孵化率可達到72.5%±3.2%，PM2.5暴露組的孵化率則隨著PM2.5濃度的升高而降低，在各劑量組中可觀察到胚胎死亡現象。當PM2.5暴露時間達到72和96 h后，對照組胚胎全部孵化，但在各暴露組中，不但有胚胎死亡現象，還有部分胚胎處于出膜前狀態，不能孵化。經過相關回歸分析，PM2.5對斑馬魚胚胎的半數致死量為(56.6±2.8) μg/mL。胚胎死亡率、孵化率是觀察胚胎發育的重要指標，本研究的結果顯示，PM2.5對斑馬魚的胚胎死亡率、孵化率均有影響。因此，PM2.5污染會導致胚胎發育受到影響。

霧霾已成為突出的大氣環境問題，引起全世界各國的廣泛關注。PM2.5會影響斑馬魚胚胎的發育，造成胚胎死亡率增加，孵化率下降，因此，研究其毒性，探索其效應機制已刻不容緩。