適合納米材料遺傳毒性評價方法的選擇

文海若邵安良陳 亮 淡 墨 胡燕平王 雪 * 徐麗明*

( 1．中國食品藥品檢定研究院國家藥物安全評價監測中心，藥物非臨床安全性評價研究北京市重點實驗室，北京 100176；2．中國食品藥品檢定研究院醫療器械檢定所，北京 102629 )

國際標準《納米技術-術語和定義-第二部分：納米對象》(Nanotechnologies-Vocabulary-Part 2： Nano-objects， ISO/TS 80004-2：2015)對納米粒子(nanoparticle)的定義[1]為：微小的物體(長度范圍約1～100 nm)，所有外部尺寸在納米級，其中納米物體最長和最短軸的長度無顯著差異。如果尺寸差異顯著(通常超過3倍)，則為納米纖維或納米板。納米材料獨特的物理化學性質及其與生物體相互作用的特性為其在食品加工、抗菌產品生產、藥物載體開發、腫瘤診療、體內示蹤等領域提供了廣泛的應用前景[2]，與此同時，也可能帶來潛在的安全風險。大量納米材料的涌現，極大程度上增加了人體與納米材料接觸的機會，因此納米材料的安全性評價成為關注的熱點。如何合理評價納米材料對人體的潛在毒性，特別是慢性或者長期毒性，預測其潛在毒性風險是目前學術界及各相關監管部門亟需解決的問題。

遺傳毒性研究是非臨床安全性評價的重要內容，是食品添加劑、化妝品、醫療器械、藥物等產品進入臨床試驗及上市前必須開展的研究項目。對納米材料的潛在遺傳毒性、致癌和致畸作用評估，是評價納米材料對人體安全性風險中極為重要的一環[3]。納米材料的遺傳毒性研究，已發展成一個專門的亞分支研究領域——納米遺傳毒理學[4]。大量文獻研究顯示某些納米材料存在遺傳毒性，且遺傳毒性可能與納米尺度有關。如非納米尺度的二氧化鈦(TiO2)的遺傳毒性為陰性，而成為納米尺度的TiO納米材料時遺傳毒性試驗結果可為陽性[5]。納米粒子的尺

2寸效應和表面活性高等特點使它極易透過細胞膜，可在表面活性和蓄積性的共同作用下，對細胞遺傳物質產生直接或間接的相互作用。尤其是攜帶金屬離子的納米粒子進入體內后有可能通過氧化應激等作用機制誘發染色體或DNA斷裂[6]。然而，當前經典的遺傳毒性試驗方法對納米材料的評價存在一定局限性。

本文就當前安全性評價常用的遺傳毒性試驗方法評價納米材料遺傳毒性的優勢和局限性進行綜述，根據遺傳毒性試驗選擇的基本原則，經濟合作與發展組織(The Organization for Economic Cooperation and Development，OECD)納米材料產品工作 組 (Working Party on Manufactured Nanomaterials， WPMN)于2014年發布的《納米材料產品遺傳毒性：OECD專家專題研討會報告 納米材料產品安全性系列文件N0.43》[7]和OECD遺傳毒性指導原則[8]，就適宜納米材料的遺傳毒性評價方法組合提出可選擇的遺傳毒性試驗方法，以及推薦使用的試驗組合方案，供納米材料毒性評價和審評工作者參考。

1 納米材料遺傳毒性的特殊性

遺傳毒性試驗的目的是通過一系列試驗預測受試物是否有遺傳毒性，從而對受試物的潛在致癌性進行預測。就納米材料開展遺傳毒性評價，有助于降低人群接觸納米材料的毒性風險。遺傳毒性試驗方法眾多，根據試驗系統不同可分為體外和體內試驗；根據檢測方法針對與腫瘤相關的遺傳終點，可大致分為3類，即基因突變、染色體損傷和DNA斷裂。目前沒有任何單一的試驗方法可同時涵蓋所有遺傳終點。為全面考察受試物的潛在遺傳毒性風險，通常需開展一系列機制上互相補充的試驗，即標準化試驗組合，來進行綜合性評價[8]。人用藥物注冊技術要求國際協調會議(International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use)在遺傳毒性標準試驗組合S2(R1)中要求，標準試驗組合的選擇應針對不同的遺傳終點，包括體外和體內研究[8]。

納米材料緩慢進入細胞又緩慢從細胞中釋放，以及體內臟器分布(易于分布于肝、腎、肺、腦及免疫器官等)、蓄積性和緩釋效應這些特點，與普通化合物和小分子生物制品有所區別，現行經典的遺傳毒性評價方法可能無法有效而可靠地進行評價。比如，與嚙齒類動物腫瘤相關度最高的傳統細菌回復性突變試驗無法有效檢出納米粒子的潛在致突變性，而體外微核試驗、染色體畸變試驗及彗星試驗卻通常可以得到陽性結果[9]。此外，納米材料進入體內后，長期存在并蓄積于某些臟器無法排出，是否會對細胞的增殖產生影響進而誘發腫瘤也是需要考慮的重要因素之一。研究顯示大鼠靜脈注射納米粒子后血液中納米粒子短時間內快速清除，大量納米粒子由循環系統進入組織[10]。而主要針對化學藥物設計的體內遺傳毒性研究通常使用外周血作為監測窗，采樣時間較短，容易對納米粒子的遺傳毒性進行誤判。在開展體內毒性研究時，需要結合其體內代謝和分布研究結果來進行毒性評價，并重點關注其靶器官遺傳毒性。

法國藥監局(Agence Nationale de Sécurité d u Mé dicament et des Produits de Santé，ANSM)在2011年發布的《含納米材料醫療器械的生物學評估》的科學報告中指出由于大量納米材料遺傳毒性研究缺乏關于納米材料理化性質鑒定的數據以及標準化而統一的試驗方法和試驗條件，不同研究中納米材料的遺傳毒性研究結果并不一致，難以對很多納米材料的遺傳毒性進行判斷[11]。歐洲的NANOGENOTOX納米遺傳毒理計劃就15種代表性納米材料(包括5種納米二氧化鈦，4種合成無定形二氧化硅，6種多壁碳納米管)使用一致的評價方法和評價標準開展試驗研究并獲得一定研究數據可用于分析參考[11]。OECD WPMN 在《納米材料產品遺傳毒性：OECD專家專題研討會報告 納米材料產品安全性系列文件N0.43》就納米材料遺傳毒性評價中的共性問題達成7項共識[7]。與會專家建議繼續對納米材料遺傳毒性相關研究數據進行深入挖掘，以確定是否需要在可能的范圍內對遺傳毒性試驗指導原則進行相應的調整。

2 遺傳毒性評價方法存在的問題及建議

2.1 細菌回復性突變試驗

2.2 哺乳動物細胞基因突變試驗

基于哺乳動物細胞的小鼠淋巴瘤細胞tk基因突變試驗(mouse lymphoma assay，MLA)和HPRT基因突變試驗除檢測致突變外，也可用于檢測致斷裂劑。從試驗方法的角度上分析，避免了Ames試驗中試驗對象與受試物無法充分接觸的多種因素，可作為檢測致突變劑的體外備選方法。然而，該方法當前主要用于安全性評價，較少應用于科研領域，因此使用其開展納米材料評價的文獻很少。回顧目前文獻報道[9]，其試驗結果基本與體外微核試驗相符。Kirkland等[15]根據文獻數據分析了MLA的預測效果，認為Ames試驗和體外微核試驗已足夠用于預測嚙齒類動物致癌性和體內遺傳毒性；在兩者的基礎上增加MLA后，檢出率僅從78%(316/405)提高至79.5%(322/405)。此外，也有文獻報道使用嚙齒類動物細胞系開展的與人源細胞開展的HPRT基因突變試驗檢測納米二氧化鈦和碳納米管的試驗結果存在一定矛盾，提示不同細胞系的敏感性及對DNA損傷的修復能力有所差異，從而對結果產生影響[16-17]。因此使用哺乳動物細胞基因突變試驗檢測納米材料遺傳毒性的可靠性和靈敏性尚有待確認，然而由于Ames試驗的不適用性，缺乏適宜的平行對照試驗方法來進行相應驗證工作。

2.3 體外微核試驗

微核試驗是檢測染色體或有絲分裂器損傷的一種遺傳毒性試驗方法。無著絲粒的染色體片段或因紡錘體受損而丟失的整個染色體，在細胞分裂后期仍留在子細胞的胞質內成為微核。體外微核試驗是常見的評價納米材料遺傳毒性的試驗方法，然而當前文獻報道的體外微核試驗方法缺乏一致性[9]，在納米材料暴露時間、添加細胞松弛素B(cytochalasin B，cytoB)的方法、全血清或低血清培養條件，以及細胞系的選擇上存在很大差異。這些試驗條件均可能對研究結果產生重要影響，導致無法對結果的可靠性進行判斷。

如納米材料進入細胞發揮作用的時間較久，建議增加細胞與納米材料接觸的時間。體外哺乳動物細胞試驗受試物處理時間至少為24 h，以保證納米材料與遺傳物質(直接或間接)充分地接觸。研究顯示細胞與納米材料作用24 h的檢出率優于48 h及更長時間，以及不超過6 h作用時間[9]。納米材料作為異物進入細胞，大多可對細胞周期產生影響。胞質分裂阻斷法微核試驗添加cytoB形成雙核細胞模型，通過計數單核、雙核、三核及更多核細胞形成率，可驗證其納米顆粒對細胞增殖的影響。針對雙核細胞計數微核的優勢是可以排除自發微核率(單核細胞微核)對背景值的影響。而胞質分裂阻斷法微核試驗中添加的雙核細胞造模試劑cytoB可干擾細胞骨架的形成，從而影響細胞對納米材料的內吞作用。cytoB的給藥方法可采用后處理或延遲的共同處理方法，從而保證納米材料可與細胞培養系統在無cytoB的情況下充分暴露。當前大多數研究中使用全血清，考慮到全血清條件可能更接近體內環境，然而血清含量可能對細胞的內吞作用產生影響，進而導致納米材料進入細胞后對遺傳物質的影響有所差異。有研究顯示培養基中的血清含量可對細胞內吞作用產生影響，具體作用可因細胞類型和納米粒子不同而異。如血清可降低人宮頸癌細胞(HeLa細胞)對二氧化硅包被的納米粒子的攝取能力，并抑制MCL-5(人類淋巴母細胞B細胞) 對超細超順磁性氧化鐵納米粒子的攝取；卻可提高RAW 264.7 (巨噬細胞)對陰離子磁性納米顆粒的攝取能力[18]。當前就體外研究中低血清條件或全血清條件哪一個更為適宜尚無定論。此外，研究顯示細胞系的選擇可能對評價結果產生重要影響，腫瘤細胞系較正常細胞系更易于獲得陽性結果。這可能與腫瘤細胞分化增殖能力旺盛，抗氧化應激能力相應較差，以及對納米材料的攝取能力較強等因素有關[19]。建議評價時結合受試物實際用途和檢測目的，并結合受試物的主要暴露靶器官，選擇適宜的細胞系開展試驗[9]。常用的細胞系包括A549細胞(人肺腺癌細胞)和HepaRG細胞(正常人終末分化肝細胞)等。

2.4 體外染色體畸變試驗

染色體畸變試驗是除微核試驗以外，另一項以染色體損傷為檢測終點的常用遺傳毒性評價方法。該方法通過分析中期分裂相細胞中染色體結構和數目的變化，并計數異常染色體結構和數目出現的頻率來評價受試物對染色體的影響。開展體外染色體畸變時在細胞系的選擇、血清的使用和納米材料與細胞作用時間上的考量與2.3體外微核試驗相同。含金屬離子的納米材料染色體畸變試驗多顯示為致斷裂性。值得注意的是，某些細胞周期抑制作用明顯的納米材料(如納米銀)可誘導多倍體發生率顯著升高[20]。該現象不排除與其抑制細胞分裂有關，可開展相關研究，如染色著絲粒的FISH法體外哺乳動物細胞微核試驗[21]，區分納米材料是否有誘發非整倍體形成的可能，并明確其產生的原因。

2.5 體內及體外Pig-a基因突變試驗

位于人的X染色體上的Pig-a基因及其同源基因的編碼區在人、小鼠、大鼠乃至酵母中高度保守，Pig-a基因突變可導致糖化磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol，GPI)合成障礙，致使細胞GPI錨蛋白缺失，該缺失可使用流式細胞術(Flow Cytometry，FCM)針對細胞表面GPI錨連蛋白(如CD59、CD55蛋白)的表達水平檢出。Pig-a基因突變率可用以評價受試物對基因突變的作用。體內試驗以紅細胞(red blood corpuscle，RBCs)或網織紅細胞(reticulocytes，RETs)表面缺失CD59或者CD55蛋白的發生率作為Pig-a基因體內突變的檢測終點[22]；體外試驗備選細胞系包括TK6細胞和L5178Y細胞，以表型為GPI(-)的細胞出現率為Pig-a體外突變的檢測終點[23]。Pig-a基因突變試驗作為新興的致突變劑檢測方法當前尚處于開發階段，未經過大規模實驗室間驗證，未形成相關指導原則，在納米材料毒性評價方面的應用更為少見。然而納米材料致突變性的檢測方法有限，該方法或可成為有效的納米材料致突變性檢測方法。

2.6 其他試驗方法

體內試驗方法選擇時，需根據受試物作用機制和體內分布蓄積情況進行選擇。其中體內紅細胞微核試驗、體內染色體畸變試驗和體內彗星試驗的具體方法均有相應指導原則參考。彗星試驗可較為靈敏地檢測致斷裂劑的作用[3]，通常體內試驗采樣的時間在末次給藥后3 h左右，其中部分斷裂可自行修復，因此不作為常規的遺傳毒性評價方法。然而彗星試驗有可針對多種臟器/組織開展研究的優勢，可結合組織分布研究評價受試物的細胞毒性和遺傳毒性。在有證據顯示受試物可致斷裂的情況下，可通過彗星試驗進一步分析其對不同臟器的影響。氧化應激是納米材料誘導DNA損傷的重要作用機制。建議開展彗星試驗時增加細菌甲酰嘧啶DNA糖基化酶(FGP)、核酸內切酶III、8羥基鳥苷DNA糖基化酶(hOGG1)等預處理，有助于分析斷裂作用是否與氧化應激有關[24]。正式試驗之前，需對FGP的處理條件進行充分驗證，避免獲得假陽性結果。針對DNA雙鏈斷裂的γ-H2AX作為遺傳毒性生物標志物或有一定的應用價值。

在體內致突變性方面，考慮到納米材料體內蓄積引起的毒性，嚙齒類轉基因動物模型，如MutaMouse，BigBlue?，Gptdelta轉基因小鼠均可結合重復給藥試驗檢測納米材料的潛在長期致突變效應[25]。

而使用放射性試劑3H-TdR標記的體內哺乳動物肝細胞非程序性DNA合成試驗，在使用條件上存在一定局限性。

家住在石門鄉間，前后有兩個小小的院子，于是，也種了不少雜七雜八的植物，按著季節，也會開出不少好看的花。有時候在廊前一坐，桂花送來淡淡的清香，覺得自己好像也安靜古雅了起來。夏天的傍晚，茉莉會不停地開，摘下兩三朵放在手心里，所有青春的記憶都會隨著它的香氣出現在我眼前。我想，我愛的也許并不是花，而是所有逝去的時光，在每一朵花后面，都有著我珍惜的記憶。

綜上所述，按遺傳毒性評價終點對評價方法進行分類，就這些方法存在的問題和可能的改良建議進行總結，見表1。

3 遺傳毒性試驗方法的特殊關注點

3.1 納米材料的制備

納米材料的物理化學性質是其毒性強弱和毒性特點的重要影響因素。相同組分的材料成為納米材料時，其生物體內代謝動力學、長期體內分布及蓄積的特征可發生明顯改變[9]，其毒性與其粒徑，表面修飾和分布密切相關[5]。納米材料在理化性質上的微弱差異可直接導致其安全窗和毒性靶器官的不同。因此安全性評價需強調納米材料的理化性質鑒定。在開展毒性評價之前，可參考OECD ENV/JM/MONO(2016)2、ISO/TR 13014：2012、ISO/TC229等相關標準，充分考察其物理化學性能和穩定性[26-28]。對于理化性質和穩定性不同的相同納米材料，需要分別評價。如果擬評價受試物為醫用納米材料或者含納米材料產品，應為可充分代表臨床試驗或上市后人擬用產品質量和安全性的樣品。

受試物制備的總體原則是最大程度上模擬受試物與人體實際接觸的方式。分散介質可影響聚集體的大小，從而影響受試物的沉降、聚集、細胞暴露、細胞毒性、劑量選擇和遺傳毒性試驗結果。單純的納米材料受試物，需充分考慮其分散性，選擇合適的介質，確保分散均勻，減少團聚。當特殊金屬納米材料可能會釋放金屬離子的情況時，需考慮所釋放的金屬離子與分散介質中離子的反應，可能會影響結果的判斷。如納米銀會釋放帶正電荷的銀離子，在分散介質，如氯化鈉(NaCl)中，當銀離子的濃度足夠高時可與介質中的氯離子形成氯化銀顆粒物。此時，應采取相應措施避免顆粒物形成，并充分評價非納米材料顆粒物對試驗體系和結果的影響。由于有些納米材料具有極強的吸附特性，特別是對蛋白成分的吸附。因此，在樣品制備時如采用含有機成分的生理介質，應充分評價納米材料對介質中有機成分的吸附，及其對試驗體系和試驗結果解釋的影響。

表1 遺傳毒性試驗方法用于納米材料毒性評價的問題與優化建議

3.2 體外遺傳毒性試驗方法的關注點[7]

體外納米材料遺傳毒性試驗可根據ICH S2(R1)細胞增殖和細胞毒性試驗結果，選擇最高受試物處理濃度[12]。某些情況下可考慮增加濃度設置間隔，設置大于標準范圍(√√ 1100倍)并在無細胞毒的情況下開展試驗，以保證獲得較好的濃度-效應關系。

為保證納米材料在體外實驗系統的生物和物理環境中的狀態與體內應用時的微環境的檢測結果有可比性，應使用現有的方法對給藥處理開始和給藥處理結束的細胞培養基中納米材料的表征進行鑒定。

考慮到納米材料可能區別于普通化合物，不會在肝臟經過復雜的代謝過程，且S9作為高蛋白組分可影響納米材料與細胞的相互作用，含納米粒子受試物的體外研究通常不設置添加S9代謝活化的試驗條件。然而尚沒有數據明確指出在安全性評價可不設置S9處理組，該試驗條件是否有意義還有待進一步考察。

納米材料細胞攝取程度也是解釋檢測結果的關鍵因素，因此建議開展體外遺傳毒性試驗時同時對細胞攝取能力進行分析。通常從直接遺傳毒性的角度分析，如哺乳動物對納米材料攝取能力有限，可提示為較低的內在風險。當前細胞納米材料攝取水平的定量分析方法通常使用電感耦合等離子體質譜(Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)的方法。細胞經受試物處理后，反復經PBS洗滌后收集細胞進行檢測。如納米材料粘附于細胞表面，細胞外的納米材料難以沖洗干凈，則檢測結果可產生一定偏差。

3.3 體內遺傳毒性試驗方法的關注點

考慮到動物實驗3R原則[替代(replacement)、減少(reduction)和優化(refinement)]，體內評價方法并非納米材料遺傳毒性評價的首選。然而體外試驗可能無法充分反應體內的條件，比如遺傳物質損傷可能是刺激免疫系統炎癥反映而間接誘導遺傳毒性，尤其是納米材料介導的短期強炎癥反應和慢性持續的炎癥反應都值得引起關注。不過當前評價免疫毒性的體外細胞因子釋放等方法與體內評價方法的一致性尚未得到充分證明，與遺傳毒性有關的具體的炎癥或免疫作用通路并不明確，且炎癥、遺傳毒性和致癌性之間的關聯還有待深入了解[25]。故開展體內研究應基于一定的體外研究基礎。此外，開展體內遺傳毒性研究前，需進行一些毒代動力學研究以確定納米材料是否到達遺傳毒性非接觸部位靶組織。在缺乏相關數據的情況下，如納米材料沒有到達靶組織，則相應試驗方法不適用于檢測初級遺傳毒性。在給藥方式上，目前沒有足夠的數據支持某種給藥方式優于另一種給藥方式。試驗給藥方式需根據人最常見的暴露途徑選擇[7]。

4 遺傳毒性試驗組合優化的考慮

根據OECD遺傳毒性試驗方法評價指導原則，以及當前文獻報道的納米材料遺傳毒性評價的特殊性，本課題組初步提出在對納米材料開展遺傳毒性評價時的試驗組合優化的關注點。具體如圖1。

圖1 納米材料遺傳毒性試驗組合優化方案

盡管當前觀點認為傳統Ames試驗不適用于納米材料遺傳毒性檢測，但Ames試驗作為對嚙齒類動物腫瘤發生率預測效果最好的遺傳毒性試驗方法，不應完全排除在現階段納米材料遺傳毒性評價組合之外。應在提供研究所用試驗條件下細菌對該納米材料攝取能力的基礎上，考慮是否選擇Ames試驗，或者作為Ames試驗結果判定的參考。而小鼠淋巴瘤tk基因突變試驗涵蓋了基因突變和染色體斷裂兩個檢測終點，可作為第2項納米材料潛在致突變能力檢測方法。體外微核試驗或體外染色體畸變試驗針對致斷裂劑在檢測終點上與Ames試驗和MLA互補，可任選一項作為第3項遺傳毒性評價方法。在提供相應研究數據的同時應提供研究所用試驗條件下細胞對該納米材料攝取能力的證據，作為試驗結果判定的參考。此外，納米材料的遺傳毒性試驗組合應參考藥物遺傳毒性試驗包括一項體內研究。可在嚙齒類動物紅細胞微核試驗、哺乳動物骨髓染色體畸變試驗或嚙齒類動物體內彗星試驗中任選一項作為組合中的第4項試驗。

如體外研究中獲得陽性結果再根據出現陽性結果的遺傳毒性終點選擇相應的體內評價方法。如果4項遺傳毒性試驗結果均為陰性，且根據受試物毒性作用機制分析不存在潛在致遺傳毒性的風險，則判斷受試物遺傳毒性結果為陰性，無需進一步評價其遺傳毒性。如果在4項遺傳毒性試驗中至少一項研究結果為陽性，則判定遺傳毒性試驗結果為陽性，考慮受試物存在遺傳毒性風險。可進一步開展與檢出陽性結果的評價終點一致的體內試驗，并針對靶器官(組織)進行研究。

5 小結

納米材料的誕生為人類帶來機遇的同時也帶來了挑戰。與普通化合物相比，納米材料的遺傳毒性評價方法和試驗條件均有所差異。如何科學地評價納米材料的遺傳毒性，成為當前亟需解決的問題。部分方法需要在傳統方法上進行一定調整和優化，而一些試驗及試驗條件，如體外細胞攝取能力評價方法的優化、體外研究是否有必要添加S9和血清含量的選擇尚有待深入探索，另有一些尚不成熟的新方法或可通過一系列條件摸索和驗證工作成為適宜納米材料的評價方法。深入開展納米材料遺傳毒性評價方法標準化和優化的工作，勢必將推進一系列新興的遺傳毒性評價方法進入安全評價領域。本文回顧了現有常用遺傳毒性評價方法用以評價納米材料的優勢與劣勢，總結了納米材料遺傳毒性評價時的關注點，并基于OECD專家工作組的相關建議及相關遺傳毒性評價指導原則初步提出納米材料遺傳毒性試驗組合優化方案，以填補相關領域的空白，為納米材料毒性評價和含納米材料產品技術審評工作提供有益的借鑒。