染料木素對人骨關節炎軟骨細胞增殖活性和蛋白分泌的影響

胡 炯，王國強，劉啟明，董黎強*，羅統富

0 引言

骨性關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種以軟骨細胞代謝異常，引起軟骨細胞退變和軟骨基質結構破壞為主的慢性病。研究表明，關節軟骨組織的破壞以Ⅱ型膠原蛋白(Collagen Ⅱ)的平衡失常，過度分解尤為顯著[1-2]。在OA進展中，軟骨細胞代謝失衡，對基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)的表達明顯增強，而MMP-13釋放至細胞外后活性啟動，進一步加重了基質中collagen Ⅱ的降解，促進關節軟骨組織的損傷、退變，加快OA的發生發展[3-4]。染料木素(Genistein,Gen)又稱染料木黃酮、金雀異黃素，其為存在于異黃酮類中植物雌激素藥理活性最強的一種成分，因其化學構建類似雌激素，故具備結合雌激素受體表現雌激素樣效應的能力。研究表明，染料木素能夠調節骨細胞的代謝，保護骨組織，延緩骨組織的退變[5]。因此，本研究通過觀察不同濃度染料木素對OA軟骨細胞增殖活性及分泌collagen Ⅱ、MMP-13水平的影響，探討染料木素在延緩OA中的機制，為治療OA提供新的途徑。

1 材料和方法

1.1 細胞、試劑和主要儀器 人軟骨細胞購自江陰齊氏生物科技有限公司。染料木素(南京廣潤生物制品有限公司)，胎牛血清(Gibco公司)，細胞增殖-細胞毒性檢測試劑盒(CCK-8)(VICMED公司)，BCA蛋白定量試劑盒(碧云天公司)，IL-1β(Recombinant proteins公司)，Anti-MMP-13 antibody、Anti-collagen Ⅱantibody(Affinity公司)，GAPDH(Bioworld公司)，戊酸雌二醇片(美國DELPHARM lille公司，批號：270A)。倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，流式細胞儀(Becton-Dickinson公司)，凝膠成像儀(Bio-RAD公司)，酶標儀(Molecular Devices公司)，pH計(Metter-Toledo GmbH公司)，電泳儀電源和小型垂直電泳槽(北京六一儀器廠)。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細胞的培養和鑒定 將人軟骨細胞接種于預先鋪有胎牛血清的培養皿中，37 ℃ 5% CO2進行培養，調整細胞狀態達到對數生長期。甲苯胺藍染色鑒定：培養皿中培養48 h后收集細胞，PBS漂洗，將細胞置于4%多聚甲醛固定(室溫)20 min，PBS漂洗，3×5 min，1%甲苯胺藍染色液染色5 min；PBS漂洗，3×5 min；蒸餾水洗1 min，不同濃度酒精分別浸泡1 min；二甲苯Ⅰ和二甲苯Ⅱ各浸泡5 min，晾干，加入中性樹膠，封片。顯微鏡下觀察。OA模型建立：將實驗分為軟骨細胞組(A組)、軟骨細胞+IL-1β處理組(B組)2組。IL-1β終濃度為10 ng/ml，IL-1β誘導1×106軟骨細胞24 h。Western blot檢測：200 μl IP裂解液裂解軟骨細胞提取細胞蛋白，BCA試劑作用后，測定562 nm處的吸光度值，計算蛋白濃度，將提取的蛋白上清與5×蛋白上樣緩沖液，進行沸水浴10 min，制備電泳膠后固定，依據Marker切下目的條帶，200 mA恒流電轉移，PVDF膜浸泡于4 ℃一抗孵育液中過夜，洗滌PVDF膜5～6次，5 min/次，二抗孵育液中，室溫搖床孵育1 h，加入ECL液化學發光顯影。

1.2.2 染料木素對OA模型軟骨細胞的影響 實驗分組：分6組，A組：軟骨細胞組(對照組)；B組：軟骨細胞+IL-1β處理組；C組：軟骨細胞+IL-1β+染料木素(25 μg/ml)處理組；D組：軟骨細胞+IL-1β+染料木素(50 μg/ml)處理組；E組：軟骨細胞+IL-1β+染料木素(100 μg/ml)處理組；F組：軟骨細胞+IL-1β+戊酸雌二醇(100 μg/ml)處理組。CCK-8法檢測細胞活力：各組藥物分別作用0、24、48、72、96 h時，取出96孔板，棄去細胞上層培養基，每孔加入100 μl含0.5% FBS的新鮮培養基，再每孔加入10 μl CCK8，37 ℃孵育4 h。將96孔板放入酶標儀，450 nm進行讀數。按“1.2.1”項方法進行Western blot檢測。

2 結果

2.1 人軟骨細胞甲苯胺藍染色結果分析 甲苯胺藍是一種堿性染料，組織中酸性物質與陽離子結合顯藍色。正常人軟骨細胞甲苯胺藍染色后細胞質呈淡藍色，細胞核呈藍色，細胞核仁呈深藍色。本研究甲苯胺藍染色顯示培養的人軟骨細胞呈異染性，證實為人軟骨細胞。見圖1。

圖1 軟骨細胞甲苯胺藍染色結果

2.2 OA模型建立及蛋白鑒定 Western blot檢測各組collagenⅡ和MMP-13蛋白水平。與A組比較，B組的MMP-13蛋白含量升高，collagen Ⅱ蛋白含量降低，差異有統計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 兩組細胞蛋白含量比較

2.3 CCK-8法檢測細胞活力 見圖2。加入不同濃度染料木素處理0 h即IL-1β處理24 h，與A組相比，細胞增殖能力下降，證明IL-1β處理減弱了細胞活力。染料木素處理24、48 h，與B組比較，D組細胞活力上調不明顯，差異無統計學意義(P=0.160，P=0.163)，而E組細胞活力顯著上調，差異有統計學意義(P<0.01)，說明染料木素濃度越高，對軟骨細胞活力促進作用越強。染料木素處理72 h，與B組比較，D組和E組的細胞活力均上調，差異有統計學意義(P<0.01)，表明濃度為50 μg/ml的染料木素對細胞活力的促進作用隨時間的延長而逐漸明顯。結果表明，IL-1β處理可以減弱細胞活力；染料木素能顯著增強1L-1β處理的軟骨細胞增殖活力；并且細胞增殖活力隨染料木素濃度的增多而增強，且與時間呈正比。從表2可知，細胞活力在96 h時較72 h時未出現明顯的升高，表示細胞數量在培養皿中逐漸達到飽和，抑制了細胞進一步增殖，而72 h時組間體現出顯著差異，故后續實驗選擇72 h作為檢測時間點。另外，IL-1β+100 μg/ml染料木素處理組與單獨加IL-1β處理組比較，OD值差距沒有擴大，證明100 μg/ml染料木素具備較好的抑制IL-1β對細胞增殖的抑制作用。見表2。

表2 B、D、E三組增殖活力比較(%)

注：*D組與B組比較，#E組與B組比較

圖2 CCK-8檢測細胞活力

注：與A組比較,**P<0.01;與B組比較,#P<0.05,##P<0.01

2.4 染料木素對OA模型軟骨細胞相關蛋白水平的影響 與軟骨細胞組比較，IL-1β處理使軟骨細胞中collagen Ⅱ表達水平降低，MMP-13表達水平升高；采用染料木素作用后，IL-1β處理的軟骨細胞中collagen Ⅱ表達水平升高，而MMP-13表達水平降低；同時，collagen Ⅱ蛋白水平隨著染料木素濃度的增加而升高，而MMP-13蛋白表達水平降低，差異有統計學意義(P<0.01)，見表3。

表3 各組細胞蛋白含量比較

注：**與A組比較，P<0.01；##與B組比較，P<0.01

3 討論

關節軟骨細胞代謝異常，軟骨基質平衡遭到破壞和降解是骨關節炎形成的主要因素[6]。collagen Ⅱ是軟骨細胞合成分泌的細胞外基質，供應軟骨細胞生存所需條件。汪建樣等[7]研究發現，生長分化因子通過刺激collagen Ⅱ的表達起到保護軟骨組織的作用。MMP-13是基質蛋白酶中裂解關節軟骨基質中效應最高的一種，最終造成關節軟骨的損傷[8]。王偉東等[9]研究發現，右歸飲通過抑制軟骨細胞分泌MMP-13，減少對軟骨基質的降解，延緩骨關節炎的進程。

軟骨細胞上存在雌激素受體，是雌激素發揮效應的靶細胞之一。雌激素調控軟骨代謝影響骨關節炎發病機制及進程，刺激基質金屬蛋白酶抑制劑的生成，降低金屬基質蛋白酶的含量，進而延緩對關節軟骨的降解[10]，同時，雌激素能夠激發蛋白多糖和Ⅱ型膠原蛋白的合成分泌，維持軟骨基質結構穩定，保護軟骨，因此，雌激素對關節軟骨在多方面均有益處。雌激素替代療法能夠恢復絕經后婦女雌激素水平，延緩骨質疏松，減低骨折發生風險，但顯著加大了子宮內膜癌、乳腺癌發生的風險。因植物雌激素來源于天然植物，其使用的安全性較高，近年來，關于植物雌激素樣活性的研究報道越來越多，植物雌激素具備類似雌激素化學結構及藥理活性的成分，能夠與人和哺乳動物內雌激素受體結合發揮其雌激素樣作用[11]。其中異黃酮類化合物是傳統中草藥內含有的一類重要的天然有機化合物[12]，該化合物中植物雌激素樣效應成分被當作雌激素受體調節劑使用。染料木素是異黃酮類化合物中藥理活性最高的物質。研究表明，染料木素能夠通過過氧化物酶體增殖物激活受體γ來刺激成骨細胞的增殖分化活性[13]，同時，染料木素能夠刺激骨形成和抑制破骨細胞的增殖分化和骨吸收功能[14]。

本實驗利用IL-1β誘導正常人軟骨細胞建立OA軟骨細胞模型，采用甲苯胺藍染色和Western blot檢測方法鑒定OA軟骨細胞模型的成功建立。CCK-8法檢測細胞活力發現，OA軟骨細胞模型較正常軟骨細胞活力下降明顯，通過不同濃度染料木素處理后，IL-1β+軟骨細胞活性大大增強，染料木素濃度越高，細胞活力增強越明顯，以100 μg/ml染料木素處理組細胞活力最強。在藥物處理72 h時，100 μg/ml染料木素處理組較正常軟骨細胞組細胞活性差距最小。100 μg/ml染料木素與雌二醇處理后，染料木素藥理效應更強。Western blot檢測發現，染料木素濃度越高，OA細胞模型中生成的collagen Ⅱ越高，而MMP-13含量逐漸下降。100 μg/ml濃度染料木素處理OA細胞較雌二醇處理達到更好的效果。提示雌二醇與染料木素均能夠延緩骨關節炎的發展，100 μg/ml染料木素延緩骨關節炎進展效果最佳，且同等濃度下染料木素藥理效應優于雌二醇。

本實驗染料木素通過刺激骨關節炎軟骨細胞活性，促進collagen Ⅱ的合成和分泌，抑制軟骨細胞產生MMP-13來達到保護關節軟骨、延緩骨關節炎發展的作用。但影響OA的發病機制眾多，染料木素是否同時參與其他因子的表達，保護關節軟骨，需要進一步的研究。