BMPR1b-siRNA對人骨髓間充質干細胞成骨分化及Smads通路的影響

張 博，于振聲，周 濤，李建章

0 引言

骨質疏松是臨床上老年人群高發(fā)的一種骨科疾病[1]，重度骨質疏松可增加患者骨折風險，且骨折后常遷延不愈，給患者身體健康及生活質量造成了巨大威脅。成骨能力受損與骨科疾病的發(fā)生發(fā)展關系密切[2]，探究成骨機制，尋找治療骨質疏松及骨折修復新思路是目前臨床骨科亟待解決的關鍵性問題。人骨髓間充質干細胞(Human bone marrow mesenchymal stromal cells,hBMSCs)[3]因其具有較強的增殖能力及多向分化潛能，是目前骨組織工程領域應用最為廣泛的種子細胞。研究表明，骨形態(tài)發(fā)生蛋白受體1b(Bone morphogenetic protein receptor 1b,BMPR1b)在骨形態(tài)發(fā)生蛋白促hBMSCs成骨事件中發(fā)揮重要作用[4]。基于此，本研究旨在應用RNA干擾(RNAi)[5]抑制BMPR1b基因表達，探討B(tài)MPR1b對hBMSCs成骨分化及Smads通路的影響，為闡明成骨分化機制提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 骨髓來源 經本院倫理會批準，取3例開放性骨折患者新鮮骨髓10 ml，所有患者了解本研究并同意簽署知情同意書，年齡21～26歲，均為男性。

1.1.2 主要試劑與儀器 新生小牛血清、DMEM培養(yǎng)基(杭州四季青生物公司)；hBMSCs成骨誘導培養(yǎng)基(廣州賽業(yè)生物有限公司)；siRNA轉染試劑，購自于美國invitrogen公司；二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)、四甲基偶氮唑藍(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)試劑盒(美國Sigma公司)；堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)檢測試劑盒(北京中生生物工程有限公司)；Trizol、DEPC、反轉錄試劑盒、SYBR PrimeScript RT-PCR Kit(日本TaKaRa公司)；紫外分光光度計(美國Beckman公司)；引物由上海生工設計并合成。CO2培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)；紫外分光光度計(美國Beckman公司)；qRT-PCR儀ABI7700(美國ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1 構建BMPR1b-siRNA表達載體 應用RNAi設計軟件，設計針對Genbank中BMPR1b基因序列的特異siRNA，根據pGC-silencerTM U6/Neo/RNAi載體，構建可在U6基因啟動子區(qū)域控制下產生短發(fā)卡狀載體質粒pBMPR1b-GFPsi。經雙酶切、PCR及測序驗證，成功構建BMPR1b-siRNA表達載體。

1.2.2 hBMSCs細胞分離與鑒定 將10 ml新鮮骨髓置于無菌離心管中，采用密度梯度離心法分離hBMSCs細胞，倒置顯微鏡下觀察hBMSCs細胞生長情況及形態(tài)，選用第3代對數生長期細胞用于實驗研究。

1.2.3 細胞轉染及誘導成骨分化 細胞常規(guī)消化后，按照2×104/孔濃度接種于培養(yǎng)板中，待細胞融合至80%時，利用脂質體Lipo fectamineTM2000將BMPR1b-siRNA質粒轉入hBMSCs(干擾組)，同時設置陰性對照組(轉染空白質粒)及空白組(未轉染質粒)，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明進行。更換成骨誘導培養(yǎng)基，進行誘導成骨分化培養(yǎng)2～21 d。

1.2.4 MTT檢測hBMSCs細胞增殖能力 利用MTT實驗檢測hBMSCs細胞增殖能力，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明書進行，采用酶聯(lián)免疫分析儀，于波長490 nm處測定各個孔樣本吸光度，以吸光度為縱坐標，時間為橫坐標，繪制生長曲線。

1.2.5 ALP活性檢測及茜素紅染色 于成骨誘導培養(yǎng)第3、7、11天，采用堿性磷酸酶試劑盒及BCA蛋白檢測試劑盒檢測各組hBMSCs細胞ALP活性，其中ALP活性用ALP/總蛋白含量表示。于成骨誘導培養(yǎng)第21天，進行茜素紅染色檢驗，具體操作嚴格按照試劑盒使用說明進行。

1.2.6 qRT-PCR檢測BMPR1b、ALP、骨鈣素(Osteocalcin,OCN)、骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)、Smad1、Smad4 mRNA表達水平 采用qRT-PCR檢測BMPR1b、成骨標志基因ALP、OCN、OPN、Smads通路關鍵基因Smad1、Smad4 mRNA表達水平。

采用Trizol法分別提取3組hBMSCs細胞總RNA，反轉錄所得cDNA用以作為qRT-PCR反應模板。qRT-PCR反應選用SYBR PrimeScript RT-PCR Kit定量擴增體系進行。反應總體積10 μl：cDNA 0.8 μl，SYBR Primix Ex Taq 5.0 μl，引物1.0 μl，RNase H2O 2.2 μl。反應條件為：95 ℃ 5 min，95℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，擴增30個循環(huán)。以GAPDH為內參，每個樣品設置3個復孔，結果采用2-△△CT方法處理，其中△△CT=(CT目的基因-CT內參基因)觀察組-(CT目的基因-CT內參基因)對照組。引物序列見表1。

1.2.7 Western blot檢測ALP、OCN、OPN、Smad1、Smad4蛋白表達水平 收集轉染后hBMSCs細胞，提取細胞總蛋白，利用BCA Protein Assay Kit試劑盒定量蛋白濃度，以GAPDH為內參，利用Western blot法檢測成骨標志基因ALP、OCN、OPN、Smads通路關鍵基因Smad1、Smad4蛋白表達水平，采用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳，具體操作嚴格按照操作步驟進行。

表1 qRT-PCR 擴增引物序列

2 結果

2.1 hBMSCs細胞分離與鑒定 倒置顯微鏡下觀察可見，本研究分離所得原代hBMSCs單個核細胞貼壁生長，形態(tài)均勻，趨于球形；第3代hBMSCs細胞形態(tài)均勻穩(wěn)定，成功分離培養(yǎng)hBMSCs細胞。見圖1。

2.2 三組BMPR1b mRNA表達水平比較 干擾組BMPR1b mRNA表達水平明顯低于陰性對照組及空白組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組與空白組BMPR1b mRNA表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。BMPR1b-siRNA轉染成功。見圖2。

圖1 hBMSCs倒置顯微鏡下觀察結果

2.3 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞增殖能力的影響 MTT實驗結果顯示，BMPR1b-siRNA可明顯抑制hBMSCs增殖能力，陰性對照組與空白組hBMSCs細胞增殖能力差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖3。

圖2 三組BMPR1b mRNA表達水平比較

圖3 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞增殖能力的影響

2.4 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞成骨分化能力的影響 ALP活性檢測結果顯示，轉染BMPR1b-siRNA后，成骨誘導培養(yǎng)第3、7、11天，干擾組ALP活性明顯低于陰性對照組與空白組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，陰性對照組與空白組ALP活性比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。即：BMPR1b-siRNA可下調hBMSCs細胞ALP活性。見圖4。

圖4 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞ALP活性的影響

茜素紅染色結果顯示，轉染BMPR1b-siRNA后，成骨誘導培養(yǎng)第21天，干擾組紅染鈣結節(jié)明顯少于陰性對照組與空白組(P<0.05)，陰性對照組與空白組茜素紅染色結果差異無統(tǒng)計學意義。BMPR1b-siRNA可明顯降低hBMSCs細胞鈣化程度。見圖5。

2.5 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞ALP、OCN、OPN表達的影響 干擾組hBMSCs細胞ALP、OCN、OPN表達水平明顯低于陰性對照組(P<0.05)，陰性對照組hBMSCs細胞ALP、OCN、OPN表達水平與空白組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖6。

2.6 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞Smad1、Smad4表達的影響 qRT-PCR及Western blot結果顯示，干擾組hBMSCs細胞Smad1、Smad4表達水平明顯低于陰性對照組與空白組(P<0.05)，陰性對照組與空白組hBMSCs細胞Smad1、Smad4表達水平比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖7。

3 討論

骨組織作為機體是一種不斷更新組織，主要由促進骨組織形成的成骨細胞及促進骨組織吸收的破骨細胞共同維持動態(tài)平衡，這種平衡一旦被破壞，則會引發(fā)骨質疏松等疾病[6]。目前，骨質疏松等骨代謝疾病所致骨折、骨缺損、骨裂等已成為臨床迫切需要解決的問題之一[7-9]，增強機體骨再生能力是治療此類疾病的關鍵所在。

hBMSCs作為一種骨髓中非造血干細胞，因其具有易于體外擴增，且可誘導成骨分化等優(yōu)點，現已成理想的種子細胞而廣泛應用于骨組織工程中[10-11]，在促進骨再生、骨愈合等方面具有較高的臨床價值。因此，本研究選取hBMSCs為研究對象，探討B(tài)MPR1b對hBMSCs成骨分化及Smads通路的影響。hBMSCs成骨分化過程設計多條信號通路，其中包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMP)/TGFβ信號通路[12-13]。BMPR1b作為BMPⅠ型受體亞型，在整個BMP/TGFβ信號通路促成骨事件中起至關重要的承上啟下作用[14]。Graul-Neumann等[15]研究表明，BMPR1b純合子錯義和無義突變與軟骨發(fā)育不了Grebe型發(fā)生密切相關。Carter等[16]研究表明，BMPR1b在強直性脊柱炎小鼠模型肢體芽細胞中表達呈明顯上調，推測其在強直性脊柱炎發(fā)病過程中起重要作用。目前，國內有關BMPR1b對hBMSCs成骨分化及Smads通路的影響研究甚少。

圖5 茜素紅染色結果(100×)

圖6 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞ALP、OCN、OPN表達的影響

注：A.qRT-PCR結果,B.Western blot結果。與空白組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

圖7 BMPR1b-siRNA對hBMSCs細胞Smad1、Smad4表達的影響

注：A.qRT-PCR結果,B.Western blot結果。與空白組比較，*P<0.05；與陰性對照組比較，#P<0.05

RNA干擾技術作為代替基因敲除技術的一種簡單、有效的遺傳工具，目前在探索基因功能、治療惡性腫瘤及傳染性疾病方面得到了廣泛應用[17-18]。采用siRNA技術阻斷哺乳動物細胞中某一特定基因，具有高效性、基因序列特異性、持續(xù)時間長等特點[19]。本研究成功構建了BMPR1b-siRNA特異性表達載體，并成功分離培養(yǎng)了hBMSCs細胞。本研究結果表明，干擾組BMPR1b mRNA表達水平明顯低于陰性對照組及空白組，陰性對照組與空白組BMPR1b mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義，提示所構建BMPR1b-siRNA載體成功干擾了hBMSCs細胞BMPR1b基因表達，可用于后續(xù)實驗研究。MTT實驗結果顯示，BMPR1b-siRNA可明顯抑制hBMSCs增殖能力，說明BMPR1b基因表達被阻斷后，hBMSCs增殖能力明顯下降，提示BMPR1b在hBMSCs增殖過程中發(fā)揮重要作用。本研究結果顯示，BMPR1b-siRNA可下調hBMSCs細胞ALP活性，茜素紅染色結果顯示，BMPR1b-siRNA可明顯降低hBMSCs細胞鈣化程度，說明BMPR1b被阻斷后，hBMSCs成骨分化能力被明顯阻斷，BMPR1b在誘導hBMSCs細胞成骨分化過程中可能發(fā)揮正向調控作用。ALP基因作為成骨細胞分化早期標志物[20-21]，OPN為成骨分化中晚期標志物[22]，OCN是成骨細胞最終分化完成的重要生化指標[23]。BMPR1b-siRNA可明顯下調ALP、OCN、OPN表達，證實BMPR1b在成骨分化過程中發(fā)揮重要正向調控作用，干擾BMPR1b表達可抑制hBMSCs細胞成骨分化。Smads家族是BMP骨形成信號通路轉導途徑中重要介質蛋白[24]，Smad1、Smad4是Smads家族重要成員，二者在破骨細胞分化過程中具有重要作用[25-26]。本研究結果表明，BMPR1b-siRNA可明顯下調Smad1、Smad4表達，提示BMPR1b與Smad1、Smad4之間可能存在某種調控作用，共同參與成骨分化過程，其所涉及具體信號通路傳導，值得后續(xù)實驗進一步探究。

綜上所述，BMPR1b-siRNA可明顯抑制hBMSCs細胞成骨分化，推測其機制可能與抑制Smads通路有關。BMPR1b可能在骨質疏松、骨不連、骨折不愈合等骨組織疾病發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用，BMPR1b有望成為骨代謝等疾病治療新靶點，具有較高的研究價值。