白及溶膠中植物蛋白的定性定量方法研究

車向前，陳 芳，常明泉*，陳 林

0 引言

白及溶膠是制備復方白及乳膏的前體原料，該溶膠是從蘭科植物白及塊莖中提取、脫色后制備而成[1]。復方白及乳膏具有軟化角質、促進細胞生長、抗氧化、保濕潤膚的功效[2-3]，用于治療黃褐斑、干性皮炎、皮膚皸裂，也可用于魚鱗病、銀屑病的輔助治療[4]。白及可用于上消化道止血、抗潰瘍、肺結核、外用抗皸裂，也用于腫瘤的栓塞治療[5]，目前，針對白及多糖的研究多集中于提取工藝、純化工藝[6]，而對其中植物蛋白的研究僅局限于將其作為雜質去除。近年研究發現，一些植物蛋白除具有動物蛋白的作用外，還具有較好的藥理活性，具有抗氧化、清除皮膚自由基的功能，該作用能抑制黃褐斑的生長，減退黃褐斑。復方白及乳膏能使黃褐斑減退并抑制其生長，可能與其含有一定量的植物蛋白有關[7]，為明確其藥理作用和活性成分，更好地控制復方白及乳膏的質量，本文應用硝酸硝化顯色法、色譜鑒別法對白及溶膠中的植物蛋白進行定性鑒別，應用考馬斯亮藍染色法對其中的植物蛋白進行定量檢測。

1 儀器及試藥

1.1 儀器 TU-1901型分光光度儀(北京普析通通用儀器有限責任公司)；BCD-610W型冰箱(博西華家用電器有限公司,功率：1.07 kW)；KM-410C型超聲震蕩儀(廣州市科潔盟實驗儀器有限公司，40 kHz)；WE-AS-10型實驗室純水機(深圳市宏森環?？萍加邢薰荆β剩?00 W)；XPE-分析天平(梅特勒-托利多公司，精度0.1 mg)；MH-1000型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司，300 W)；試管架(江蘇新康醫療器械有限公司，13×50)；玻璃試管(20 ml、10 ml)。

1.2 試藥 白及溶膠(太和醫院自制，批號：20170322、20170410、20170416)；牛血清蛋白對照品(中檢院，批號:160427-203942,25.0 mg/瓶)；考馬斯亮藍G-250(購自成都艾科達化學試劑有限公司，CBB，批號：6401-58-1)；乙醇(武漢市中天化工有限責任公司，批號:20161225，分析純)；85%磷酸(武漢市中天化工有限責任公司，批號:20161212，分析純)；85%濃硝酸(武漢市中天化工有限責任公司，批號:20160701，分析純)；NaCl(沈陽試劑廠,批號:2016010599，含量95%～100.05%，基準試劑)；純化水(太和醫院新鮮)。

2 方法與結果

2.1 定性鑒別

2.1.1 硝化反應 陽性對照：取濃度為1 mg/ml的蛋白質對照品溶液2 ml于試管中，滴加濃硝酸2滴，靜置2 min,觀察顏色變化，結果呈黃色。供試品溶液：取白及溶膠0.1 g于試管中，加純化水2 ml，超聲分散溶解，滴加濃硝酸2滴，靜置2 min,觀察顏色變化，結果呈黃色，與對照品反應顏色一致。陰性對照：取純化水2 ml于試管中，滴加濃硝酸2滴，靜置2 min,觀察顏色變化，結果澄清，無黃色呈現。

2.1.2 色譜鑒別 陽性對照：取濃度為10 mg/ml的蛋白質對照品溶液5 ml，加入雙縮脲試劑5 ml，搖蕩均勻，顯紫色；供試品溶液:取白及溶膠10 g,加純化水10 ml，超聲溶解，過濾，收集濾液在水浴上蒸發至5 ml，加入雙縮脲試劑5 ml，搖蕩均勻，顯紫色；陰性樣品溶液:取純化水5 ml，加入雙縮脲試劑5 ml，搖蕩均勻，溶液呈淺藍色，無紫色出現。取上述3種染色液，以相應試劑為空白，在紫外分光光度儀上于400～700 nm波長處掃描，結果對照品溶液和供試品溶液在540 nm處均有最大吸收峰，陰性樣品溶液在該波長處無最大吸收。

2.2 定量檢測

2.2.1 溶液的制備 ①0.15 mol/L NaCl溶液的制備：精密稱取0.438 7 g NaCl于50 ml容量瓶中，加純化水溶解，定容,即得。②考馬斯亮藍染色液的制備:精密稱取考馬斯亮藍50 mg溶于25 ml乙醇中，加入磷酸50 ml，混合，加純化水稀釋至500 ml，即得。③蛋白質對照品溶液的制備:精密稱取牛血清蛋白對照品10 mg，置10 ml容量瓶中，加純化水溶解，定容，即得1.0 mg/ml蛋白質對照品儲備液，該溶液置冰箱中低溫保存(4 ℃)，取該溶液0.2 ml于試管中，加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml，加入考馬斯亮藍G-250溶液10.0 ml，混勻，在室溫放置5 min，使其反應充分，即得。④樣品溶液的制備:取白及溶膠0.1 g于試管中，加0.15 mol/L NaCl溶液至2.0 ml,超聲溶解，加入考馬斯亮藍G-250溶液10.0 ml，混勻，放置5 min,使其反應充分，即得。⑤空白樣品溶液的制備:精密吸取0.15 mol/L NaCl溶液2 ml于試管中，加入考馬斯亮藍G-250溶液10.0 ml混勻，在室溫放置5 min,使其反應充分，即得。

2.2.2 測定波長的選擇 分別取“2.2.1”項下的蛋白質對照品溶液、樣品溶液和空白樣品溶液，在分光光度儀上于500～700 nm波長處掃描，記錄掃描圖，結果除空白樣品溶液外，蛋白質對照品溶液、樣品溶液在595 nm處都有最大吸收，設定595 nm為測定波長，掃描圖見圖1。

圖1 紫外掃描圖

2.2.3 曲線方程的建立 分別精密吸取“2.2.1”項下濃度為1.0 mg/ml的蛋白質對照品儲備液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 ml于10 ml試管中，每管加0.15 mol/L的NaCl溶液至1.0 ml，混勻，分別取0.1 ml于對應編號的新試管中，分別加入考馬斯亮藍G-250溶液5.0 ml混勻，放置5 min,使其反應充分，即得每毫升含蛋白質對照品為3.92、7.84、11.76、15.69、19.61 μg的溶液,取各溶液分別在設定波長處測定吸收度，讀數3次，取均值，用濃度值作為橫坐標，用測得的吸收度值作為縱坐標，制定曲線方程：Y=0.036 X-0.000 5，r=0.999 5,蛋白質對照品在3.92～19.61 μg/ml范圍內呈良好的線性關系。

2.2.4 精密度試驗 取“2.2.1”項下的蛋白質對照品溶液和空白樣品溶液，在設定波長處連續測定吸光度5次，結果RSD為0.77%。

2.2.5 穩定性試驗 取“2.2.1”項下經染色后的蛋白質對照品溶液，在設定波長處于0、1、3、6 h測定，記錄吸光度值，結果RSD為1.89%，表明蛋白質對照品溶液在6 h內穩定。

2.2.6 重復性試驗 平行精密稱取白及溶膠0.1 g于試管中，共5份，按“2.2.1”項下樣品溶液制備方法制備溶液，取“2.2.1”項下的空白樣品溶液，在設定波長處測吸光度，計算每份樣品的含量，結果RSD為1.34%。

2.2.7 回收率試驗 精密稱取已知含量的白及溶膠(批號：20170410)0.05 g，共9份，每3份為1組，分別按樣品含量的80%、100%、120%加入蛋白質對照品溶液，按“2.2.1”項下樣品溶液的方法制備，取該項下的空白樣品溶液，在設定波長處測吸光度，計算各樣品溶液的含量，回收率計算結果見表1。

表1 白及溶膠中植物蛋白回收率實驗表(n=9)

2.2.8 含量測定 精密稱取白及溶膠0.1 g(批號：20170322、20170410、20170416)于試管中，每個批號各3份，按“2.2.1”項下的方法制備樣品溶液，取該項下的空白樣品溶液，于設定波長處分別測定各份樣品溶液的吸光度值，結果見表2。

表2 白及溶膠中植物蛋白含量測定結果(n=3)

3 討論

植物蛋白中具有苯環的氨基酸結構，這類物質遇濃硝酸生成黃色化合物，既硝化現象[8]，利用該原理可以對白及溶膠中的植物蛋白進行定性鑒別。蛋白質分子中含有很多似雙縮脲結構肽鍵，雙縮脲試劑是一個藍色的含銅堿性試劑，能與蛋白質中的肽鍵形成紫色的絡合物，顏色深淺與蛋白質濃度成正比，雙縮脲試劑染色后的含蛋白質溶液在紫外可見光譜為540 nm的波長處有最大吸收[9]，應用該原理可以對白及溶膠中的植物蛋白進行色譜鑒別。白及溶膠溶解液蒸發是為了縮小體積提高濃度，增加染色時的靈敏度。

考馬斯亮藍G-250在游離狀態下呈紅色，與蛋白質發生特異性結合后立即呈現藍色。該溶液在紫外分光光度儀上在一定的波長范圍內具有最大吸收,在相應濃度范圍內，蛋白質與染色劑的結合量與測定波長的吸光度值成正比[10]，因而采用考馬斯亮藍染色法測定白及溶膠中的植物蛋白含量。

白及溶膠中不僅有多糖、植物蛋白，還有植物色素等物質，植物色素可能也產生一定的光密度值，因此，在配制樣品時，應使蛋白質濃度在0.1 mg/ml以內，必要時適當增加考馬斯亮藍染色液的用量，以保證與蛋白質染色反應完全，減小其他成分對蛋白質測定可能產生的影響。酸堿對植物蛋白的測定會有一定影響，樣品配制時加入0.15 mol/L NaCl溶液稀釋，可緩沖其影響。在測定實驗之前應把本實驗所用器具用鉻酸鉀清潔液浸泡、用純化水清洗干凈，并避免使用石英吸收池，防止用具不潔對測定結果產生干擾，每次測定完畢用乙醇清洗比色皿，然后用純化水清洗，以免考馬斯亮藍染色液在比色皿上存在殘留。