花椰菜ERF114基因的克隆及Gateway技術構建表達載體

韓占品，任 健，于瑋瑋，范夕玲，李 慧*

(1.天津農學院園藝園林學院，天津 300384；2.天津農學院基礎科學學院，天津 300384)

【研究意義】花椰菜，又稱菜花、花菜或椰菜花，是十字花科蕓薹屬一年生植物，是世界上最重要的蔬菜作物之一，其營養價值和藥用價值極高，在消費市場占有重要地位。在我國花椰菜屬于外來種，本身種質資源匱乏[1]，且近幾年我國很多地區土壤鹽漬化及干旱問題日益嚴重，干旱和高鹽堿已成為限制花椰菜品質和產量的主要因素。ERF轉錄因子作為植物特有的一類轉錄因子，其家族成員可以通過識別和特異性結合GCC-box，在植物抵抗生物和非生物脅迫過程中發揮重要的作用[2]?！厩叭搜芯窟M展】近幾年，AP2 /ERF 家族轉錄因子已在多種植物中被克隆和鑒定，大量研究表明過表達ERF可以提高植物的抗逆性。過量表達番茄TERF1基因可以提高其耐旱耐鹽性[3]，煙草NtERF5過表達可以提高其對煙草花葉病毒的抗病性[4]；在煙草中過表達大白菜BrERF11[5]和辣椒CaERF5[6]通過水楊酸，茉莉酸和乙烯途徑介導抗病基因的表達，從而提高煙草對青枯病的抗病性；小麥TaERF3轉錄因子的過表達，可以提高小麥的耐鹽和耐旱性[7]；楊樹ERF76的過表達可以上調脅迫相關基因的表達并提高ABA和GA的合成，從而提高了楊樹的耐鹽性[8]?！颈狙芯壳腥朦c】AP2 /ERF 轉錄因子是一類植物特有的重要轉錄因子超家族，其參與植物生長發育和各種逆境環境脅迫響應過程[9]。根據AP2結構域數量和識別序列不同, 該家族被分為5個亞家族: AP2、ERF、DREB、RAV和Soloist[10]。其中ERF是植物特有的一類重要轉錄因子，其家族成員均含有一個由57～66個保守的氨基酸殘基組成的AP2 /ERFDNA結合域[11]。其結構域包含3 個β 折疊和1個α螺旋，在植物增強抗病性和非生物脅迫耐性中起重要作用。【擬解決的關鍵問題】研究表明，ERF是參與植物的生物和非生物脅迫誘導的功能基因，本研究克隆了1個花椰菜的ERF轉錄因子，采用生物信息學方法對其進行預測分析，構建其表達載體，為后續花椰菜ERF轉錄因子功能及調控機制研究奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

花椰菜“津品70”，由天津市科潤蔬菜研究所孫德嶺研究員惠贈。

高保真酶Primer Star DNA聚合酶，DNA凝膠回收試劑盒，質粒DNA小量純化試劑盒，M-MLV反轉錄酶，限制性內切酶NheΙ等均購自大連寶生物公司； pENTRSD /D-TOPO，LR ClonaseTMEnzyme Mix購自Invitrogen公司；大腸桿菌菌株 DH5α感受態購自北京全式金生物技術有限公司；農桿菌菌株LB4404由南開大學陳德富教授惠贈；總RNA提取試劑盒購自上海普洛麥格生物產品有限公司；引物合成和測序有上海生工測序公司完成。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA的提取和反轉錄 按照總RNA提取試劑盒的操作說明提取花椰菜葉片總RNA，經NanoDrop核酸定量檢測儀檢測其純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性后，按照反轉錄說明書合成cDNA第一鏈。

1.2.2ERF114全長cDNA引物設計及RT-PCR基因的擴增 利用primer premier 5.0軟件設計ERF114基因的特異性引物，根據Gateway技術構建表達載體的要求，在引物5' 端加上CACC。引物序列如下：

ERF114-F: 5′CACCATTTTCTCGAATTGAATGA TTTGGGCCC3′

ERF114-R: 5′CTGATTTGTG TGTGCCTCGGTT ACG3′

采用高保真酶Primer Star DNA聚合酶進行PCR擴增，反應程序：98 ℃預變性30 s，然后進行35 個循環：98 ℃ 30 s，57℃ 30 s，72 ℃ 30 s，循環結束后72 ℃ 10 min 延伸反應，4 ℃保溫。2 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物。

1.2.3 花椰菜ERF114蛋白序列的生物信息學分析 利用生物信息學軟件，對花椰菜ERF114蛋白的氨基酸組成和理化性質、親/疏水性、跨膜結構域、磷酸化位點、二/三級結構和功能結構域進行預測和分析(表1)。

1.2.4 利用Gateway技術構建花椰菜ERF114基因的表達載體 ① BP反應。將PCR產物與入門載體pENTRSD /D-TOPO進行BP重組反應，反應體系：目的基因PCR產物3 μl， 鹽溶液1 μl，水1 μl，入門載體pENTRSD /D-TOPO 1 μl，輕輕混勻Mix后，室溫反應10 min，然后取2 μl熱激法轉化大腸桿菌感受態，涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB篩選培養板上，37 ℃過夜培養，挑取單克隆于不含抗生素的LB液體培養基中擴繁6～8 h，后進行菌液PCR鑒定，并送生工測序驗證獲得重組質粒。② LR反應。

表1 生物信息學分析軟件及在線分析工具

M：1000 bp marker ；1：ERF114基因圖1 ERF114基因全長編碼序列的擴增Fig.1 Amplification of the full-length coding sequence of ERF114 gene

反應體系：入門載體4 μl，目的載體2 μl，TE Buffer 2 μl，LR ClonaseTMEnzyme Mix 2 μl，25 ℃ 反應1 h后，加入1 μl蛋白酶K溶液，37 ℃反應10 min終止反應。取3 μl反應產物熱激轉化大腸桿菌感受態。將轉化的細胞均勻涂布于含50 mg/L 卡那霉素的LB篩選培養基上，37 ℃培養12～16 h，挑取單克隆于LB液體培養基中擴繁6～8 h，后進行菌液PCR鑒定。鑒定正確后獲得過表達載體。

2 結果與分析

2.1 ERF114基因的克隆

以花椰菜子葉cDNA第一條鏈為模板，用高保真酶Primer Star DNA聚合酶進行PCR擴增，得到了約680 bp左右的cDNA片段(圖1)，長度與預期的一致。

2.2 花椰菜ERF114基因序列的生物信息學分析

2.2.1ERF114系統進化分析 用DNAMAN將花椰菜的轉錄因子ERF114與油菜(Brassicanapus，XP_013718191.1)、甘藍(Brassicaoleraceavar.oleracea，XP 010273830.1)、白菜(Brassicarapa，XP_018515123.1 )、蘿卜(Raphanussativus，XP_018489632.1)、山崳山菜(Eutremasalsugineum，XP_006394454.1)、天藍遏藍菜(Noccaeacaerlescens，JAU35442.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana，NP_196348.1)、擬南芥琴亞種(Arabidopsislyratasubsp.lyrata，XP_002866459.1)、天藍遏藍菜(Noccaeacaerμlescens，JAU62998.1)、薺菜(Capsellarubella，XP_006279688.1)和亞麻薺(Camelinasativa，XP_010457918.1)等物種的ERF轉錄因子的蛋白序列進行比對，發現花椰菜ERF114的氨基酸序列與油菜ERF114的高度一致。對該蛋白的功能結構域進行分析(圖2)，結果顯示其含有1個AP2 /ERF保守結構域，進一步證實了該轉錄因子屬于ERF亞家族。從圖3顯示，ERF114的AP2結構域具有1個保守的WLG和YRG元件，第14位為丙氨酸(A)，19位為天冬氨酸(D)，符合典型的AP2/ERF轉錄因子的特征。進一步構建同源進化樹(圖4)，結果表明其與油菜的ERF位于同一進化分支，親緣關系最近，與其他植物的ERF的氨基酸序列親緣關系稍遠。

2.2.2 ERF114蛋白的理化特性和功能位點分析 使用在線軟件ProtParam,對花椰菜ERF114進行一級結構預測，結果表明：ERF114 蛋白等電點為5.45，分子量為25425.61Da；脂肪系數為48.01，平均疏水性為-1.006；蛋白質不穩定系數為65.01，當蛋白質不穩定系數>40時，蛋白質不穩定。由于蛋白質親/疏水性是氨基酸結構預測和功能分析的指標。采用在線軟件ProtScale對花椰菜ERF114蛋白進行親/疏水性分析(圖5a)，結果顯示，花椰菜ERF114大部分氨基酸屬于親水性氨基酸，說明花椰菜ERF114蛋白質結構可能是不穩定的。TMHMM 預測該蛋白的跨膜結構，結果發現該蛋白有一個跨膜區(圖5b) 。進一步利用Predictprotein對ERF114蛋白進行磷酸化位點(圖6)分析，結果顯示該蛋白具有19個絲氨酸(Ser)，6個蘇氨酸(Thr)和2個酪氨酸 (Tyr)磷酸化位點。

2.2.3 花椰菜ERF114蛋白的結構特征及蛋白功能分析 利用Predictprotein對ERF114蛋白進行二級結構預測，結果表明(圖7a)，花椰菜ERF114蛋白的二級結構中α-螺旋占30.09 %，β-折疊占12.39 %，環肽鏈占6.64 %和無規則卷曲結構占50.88 %。進一步利用 CPHmodel對ERF114進行三級結構(圖7b)預測和分析，結構表明該蛋白主要由無規則卷曲，α-螺旋結構，β-折疊及環肽鏈組成，其預測結果與所預測的二級結構一致。利用ProtFun 2.2 Server對該蛋白進行功能結構域預測(表2)，結果顯示轉錄調控占1.095 %，生長因子占10.337 %，其他功能所占比列較低。說明花椰菜ERF114蛋白很可能主要參與轉錄調控和植物生長發育的過程。

圖2 花椰菜ERF114蛋白功能結構域分析Fig.2 Functional domain analysis of cauliflower ERF114 protein

圖3 花椰菜ERF114蛋白與其他物種中ERF蛋白的氨基酸序列比對分析Fig.3 Amino acid sequence analysis of ERF114 protein in cauliflower and other species

圖4 不同物種中ERF114同源基因系統進化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of ERF114 homologous genes in different species

2.3 Gateway克隆技術構建花椰菜ERF114的表達載體

2.3.1 BP重組反應 將用高保真酶擴增獲得的花椰菜ERF114基因片段與入門載體pENTRSD /D-TOPO進行 BP 重組反應。得到的產物轉化大腸桿菌 DH5α感受態，長出的菌落進行菌液PCR檢測(圖8a)。結果表明，所挑取克隆均為陽性，提取質粒，單酶切后(圖8b)作為入門載體。

2.3.2 LR反應 入門載體和目標載體在LR ClonaseTMEnzyme Mix 作用下進行LR重組反應，取2 μl反應產物轉化大腸桿菌感受態，卡那霉素(50 mg/mL)

+ 為親水性信號，-為疏水性信號圖5 花椰菜ERF114氨基酸序列的親/疏水性(a)和跨膜結構分析(b)Fig.5 Pro/hydrophobic (a) and transmembrane structure analysis (b) of the amino acid sequence of cauliflower ERF114

圖6 花椰菜ERF114蛋白磷酸位點分析Fig.6 Analysis of phosphate site of cauliflower ERF114 protein

圖7 花椰菜ERF114蛋白二級結構(a)和三級結構(b)預測分析Fig.7 Analysis of secondary structure (a) and tertiary structure (b) of cauliflower ERF114 protein

M：1000 bp marker；a：1～3為陽性克??；b:1未切質粒；2～3 單酶切質粒圖8 BP反應菌液PCR鑒定圖(a)及陽性質粒酶切圖(b)Fig.8 BP reaction bacteria PCR identification (a) and the positive plasmid cleavage map (b)

M：1000 bp DNA marker；1～9：ERF114-S/A引物PCR檢測；10～18：35S/ERF114-A引物PCR檢測圖9 農桿菌重組質粒陽性克隆PCR檢測Fig.9 PCR detection of recombinant plasmid positive clones of agrobacterium tumefaciens

篩選后挑取單克隆搖菌并用目的引物和組合引物進行菌液PCR 檢測(圖9)。結果表明，目的引物和組合引物PCR獲得的條帶大小和預期相符，說明目的片段成功重組到目標載體pEarleyGate 103中，植物表達載體pEarleyGate 103- ERF114構建成功。

3 討 論

近年來，隨著社會經濟的飛速發展，全球環境問題日趨嚴重，花椰菜在栽培過程中受到了一定程度的干旱、低溫、鹽堿等逆境脅迫，這些對花椰菜的品質和產量會造成一定程度的影響。AP2/ERF轉錄因子在生物和非生物脅迫響應應答方面發揮重要作用，因此，對花椰菜AP2/ERF轉錄因子結構和功能的預測研究，可為研究花椰菜抵御和適應逆境機制，培育抗逆新品種奠定重要基礎。

ERF是AP2/ERF家族的一個亞家族，廣泛存在于植物中，含有一個由60～70個氨基酸組成的AP2/ERF結構域，其結構域的第14和19為丙氨酸和天冬氨酸[12]，主要通過特異性識別GCC盒在植物抵抗生物脅迫過程中發揮重要作用。本試驗成功地克隆了花椰菜轉錄因子ERF114，通過生物信息學手段對所獲得花椰菜ERF114基因的保守結構域進行分析，結果顯示ERF114具有一個AP2結構域，具有YRG和MLG保守區域，其二級結構具有3個β-折疊和1個α-螺旋結構，且第14和19位氨基酸分別為丙氨酸和天冬氨酸。其符合AP2/ERF 保守結構域的典型特征。結構決定功能，僅僅知道基因和氨基酸序列并不能充分了解蛋白質的功能，蛋白質空間結構的研究越來越重要。通過ProtParam預測得到該蛋白不穩定系數為65.01，是一種親水性蛋白，具有一個跨膜結構，其可能是一個不穩定蛋白。對ERF114進行功能預測發現其可能主要參與植物的生長發育及轉錄調控過程。

Gateway克隆技術是一種新型的通用型克隆技術，其主要利用λ噬菌體體外位點特異性重組的特點構建載體，Gateway主要通過BP和LR 2個反應將目的基因構建到表達載體中[13-15]。該技術于傳統的構建載體的方法相比，整個過程中不需要內切酶和連接酶的，能更加高效快速地構建植物表達載體。本試驗通過該方法成功的構建了花椰菜ERF114的植物表達載體，為今后ERF114基因的功能研究奠定了基礎。

4 結 論

本研究從花椰菜中克隆獲得了一個花椰菜ERF轉錄因子，將其命名為：ERF114，該基因全長為681 bp，編碼226個氨基酸，具有一個AP2結構域，其結構域的第14 和19位氨基酸分別為丙氨酸和天冬氨酸。同源性分析和系統進化分析結果表明，ERF114與油菜(XP_013718191.1)在同一進化分支上，親緣關系最近。生物信息學分析結果顯示，該蛋白分子量為25.42 kDa，等電點5.45，是一種不穩定的親水性非分泌蛋白。二/三級結構分析顯示該蛋白具有3個α-螺旋和1個β-折疊。為進一步探究花椰菜ERF114的功能，運用Gateway克隆技術通過BP和LR反應成功構建了植物表達載pEarleyGate 103-ERF114。