分光光度法在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

林建春

(浙江省溫州市洞頭區(qū)第一中學(xué) 325700)

生物學(xué)實(shí)驗(yàn)是高中生物學(xué)課程學(xué)習(xí)的重要組成部分，在培養(yǎng)學(xué)生探究能力及形成生物科學(xué)素養(yǎng)等方面發(fā)揮著重要的作用。其中，生物定量分析實(shí)驗(yàn)有利于學(xué)生體驗(yàn)科學(xué)研究過程，促進(jìn)學(xué)生理性思維形成。然而，由于生物定量分析實(shí)驗(yàn)具有操作要求嚴(yán)格、耗時(shí)多以及對(duì)儀器設(shè)備要求高等局限性，因而難以在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課堂中有效開展。因此，急需一種操作簡(jiǎn)單、快速有效的定量分析方法應(yīng)用于高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

分光光度法，又稱比色法，是一種常見的定量分析方法，具有操作容易、分析快速等優(yōu)點(diǎn)，普遍運(yùn)用于科學(xué)研究及高校實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。在國(guó)外，分光光度法已廣泛應(yīng)用于高中實(shí)驗(yàn)教學(xué)[1，2]。然而，我國(guó)并未重視分光光度法在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的應(yīng)用。本文簡(jiǎn)單介紹分光光度法的分析原理，評(píng)估高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中實(shí)施分光光度法的可行性，并進(jìn)一步探究分光光度法在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)中的具體應(yīng)用，最后提出幾點(diǎn)實(shí)施建議，以期將分光光度法推廣應(yīng)用于高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。

1 分光光度法原理簡(jiǎn)介

分光光度法是根據(jù)不同濃度溶液對(duì)某一特定光的吸收強(qiáng)度(吸光度)不同從而對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析的方法。其定量基礎(chǔ)為朗伯-比爾(Lambert-Beer)定律，即溶液吸光度=溶液吸光系數(shù)×溶液層厚度(cm)×溶液濃度(g/dm3)。其中，吸光系數(shù)與溶液自身性質(zhì)、測(cè)定溫度及波長(zhǎng)等因素有關(guān)。當(dāng)溶液吸光系數(shù)和溶液層厚度固定時(shí)，吸光度與溶液濃度成線性關(guān)系。根據(jù)此定律，可實(shí)現(xiàn)溶液中物質(zhì)的定量分析。分光光度計(jì)，又稱光譜儀，是測(cè)定溶液吸光度值最為常見的科學(xué)儀器。

2 分光光度法在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中實(shí)施的可行性分析

目前，高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)存在多種問題，如教師缺少對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)的研究；實(shí)驗(yàn)內(nèi)容增加，但教學(xué)課時(shí)不足；學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作積極性不高，課堂實(shí)施困難；實(shí)驗(yàn)條件不足等[3]。根據(jù)以上存在的問題，從以下4方面評(píng)估分光光度法在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中實(shí)施的可行性。

2.1 成熟的定量分析技術(shù) 分光光度法是一種成熟的定量分析技術(shù)，有大量文獻(xiàn)作為高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課堂開展的理論基礎(chǔ)，如科學(xué)研究中利用分光光度法測(cè)定微生物的生物量[4]，采用雙縮脲—分光光度法測(cè)定溶液中蛋白質(zhì)的濃度[5]。教師可通過查閱文獻(xiàn)等途徑，加強(qiáng)相關(guān)知識(shí)的學(xué)習(xí)，彌補(bǔ)對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)缺乏研究的不足，并增強(qiáng)自身的實(shí)驗(yàn)研究能力。

2.2 測(cè)定時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單 科學(xué)研究中定量分析方法有多種，如高效液相色譜法、氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀法等。盡管這些儀器定量精確，但由于儀器操作復(fù)雜、設(shè)備昂貴，不太適合應(yīng)用于高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)。由于高中課堂每節(jié)課的時(shí)間為40～45min，分光光度法分析測(cè)定時(shí)間短，操作簡(jiǎn)單，有利于實(shí)驗(yàn)教學(xué)中時(shí)間的合理控制。

2.3 定性實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)向定量實(shí)驗(yàn)，提升學(xué)生實(shí)驗(yàn)操作積極性 簡(jiǎn)單的定性分析結(jié)果，學(xué)生可通過教材直接獲取。僅開展定性分析實(shí)驗(yàn)，會(huì)降低學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作興趣，難以調(diào)動(dòng)實(shí)驗(yàn)操作積極性，從而使生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課堂實(shí)施困難。而在課堂中應(yīng)用分光光度法進(jìn)行定量分析，從而使定性實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)向定量實(shí)驗(yàn)，并采取“小組合作，師生共探究”的課堂組織方式，不僅能提高學(xué)生的實(shí)驗(yàn)操作興趣，同時(shí)也符合新課標(biāo)提倡的“自主、合作、探究”學(xué)習(xí)方式。

2.4 儀器高效利用 分光光度法并不是只應(yīng)用于高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的某一個(gè)實(shí)驗(yàn)，而是可以應(yīng)用于物質(zhì)濃度、微生物數(shù)量和酶活性分析等三大類實(shí)驗(yàn)中，從而實(shí)現(xiàn)儀器的高效利用。

3 分光光度法在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的具體應(yīng)用

新課標(biāo)高中生物學(xué)考試大綱中，必修課生物學(xué)實(shí)驗(yàn)共有19個(gè)，分光光度法可用于其中的5個(gè)實(shí)驗(yàn)，可歸納為溶液濃度、微生物數(shù)量和酶活性測(cè)定3大類。

3.1 物質(zhì)定量分析 教材中僅對(duì)還原糖(尿糖)和蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析，即根據(jù)顏色反應(yīng)判斷溶液中是否存在這些物質(zhì)。定性分析的結(jié)果，學(xué)生可通過教師在課堂中的知識(shí)講解，或通過課外輔導(dǎo)材料預(yù)習(xí)后就能獲得。對(duì)物質(zhì)進(jìn)一步進(jìn)行定量分析，如將“檢測(cè)牛奶中的蛋白質(zhì)存在情況”轉(zhuǎn)變成“比較不同品牌牛奶中蛋白質(zhì)的含量高低”，可增強(qiáng)學(xué)生對(duì)實(shí)驗(yàn)操作的興趣。盡管在光合色素的分離和提取實(shí)驗(yàn)中，可以根據(jù)紙層析結(jié)果大致判斷出各種色素含量(半定量)，但運(yùn)用分光光度法可以獲得更準(zhǔn)確的數(shù)值，幫助學(xué)生更直觀、更理性地認(rèn)識(shí)樣品中光合色素的含量。

3.2 微生物數(shù)量分析 利用分光光度法可以直接測(cè)定微生物培養(yǎng)液的吸光度值，吸光度值越大，表明培養(yǎng)液濁度也越大，從而能夠根據(jù)吸光度值間接反映培養(yǎng)液中微生物的數(shù)量(教材中的比濁法是將培養(yǎng)液的濁度與標(biāo)準(zhǔn)濁度進(jìn)行比較，從而得到半定量結(jié)果)。根據(jù)不同培養(yǎng)時(shí)間點(diǎn)培養(yǎng)液的吸光度值，以發(fā)酵時(shí)間為橫坐標(biāo)、吸光度值為縱坐標(biāo)建立微生物數(shù)量的動(dòng)態(tài)變化曲線。可以將此方法獲得的微生物數(shù)量動(dòng)態(tài)變化曲線，與血球計(jì)數(shù)法、比濁法獲得的曲線進(jìn)行比較分析。

3.3 酶活性分析 教材中“探究影響酶活性的因素”實(shí)驗(yàn)僅設(shè)計(jì)了觀察實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，如H2O2裂解釋放O2速度。將分光光度法應(yīng)用于酶活性分析，同樣可以獲得更直觀、更具體的數(shù)值結(jié)果。目前，應(yīng)用分光光度計(jì)測(cè)定酶活性的研究報(bào)道很多，具體可參考文獻(xiàn)進(jìn)行操作，如利用分光光度計(jì)測(cè)定過氧化氫酶[6]，淀粉酶[7]等酶活性。

4 分光光度法在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中的實(shí)施建議

為了更好地將分光光度法應(yīng)用在高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中，提出以下3點(diǎn)實(shí)施建議：

4.1 課前查資料 由于分光光度法技術(shù)成熟，教師可事先查閱文獻(xiàn)，尋找待測(cè)物質(zhì)最適吸收波長(zhǎng)，如雙縮脲試劑—分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的波長(zhǎng)為540nm[5]，微生物生物量測(cè)定的最適波長(zhǎng)為600nm[4]。并且，盡可能以教材中的定性方法為主，輔之分光光度法進(jìn)行定量分析。如蛋白質(zhì)的測(cè)定方法有雙縮脲試劑法、Lowry法等，但建議采用雙縮脲試劑法先進(jìn)行定性分析，再進(jìn)行定量檢測(cè)。

4.2 課堂分組合作 將全班學(xué)生劃分成若干個(gè)小組，組內(nèi)同學(xué)分工協(xié)作，一起完成實(shí)驗(yàn)。分組的目的在于縮短實(shí)驗(yàn)操作時(shí)間，留足夠多的時(shí)間進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析等。

4.3 師生共同分析 對(duì)獲得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，教師要與學(xué)生共同進(jìn)行分析，以及繪制相應(yīng)圖表，獲得直觀的結(jié)果展示。如比較不同品牌牛奶中蛋白質(zhì)含量的高低，學(xué)生首先要獲得不同牛奶樣品的吸光度值，師生一起根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算牛奶中蛋白質(zhì)的含量，進(jìn)而比較含量高低，得出結(jié)論。圖1為3大類實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果展示參考圖。其中，A為不同溶液中物質(zhì)含量比較分析；B為微生物生長(zhǎng)曲線；C為pH、溫度等因素對(duì)酶活性的影響。

圖1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示

盡管定量分析方法有多種，但分光光度法由于自身所具有的優(yōu)勢(shì)，可以廣泛應(yīng)用于高中生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中。教師可以有選擇地進(jìn)行幾個(gè)實(shí)驗(yàn)，將分光光度法拓展運(yùn)用于必修課程的實(shí)驗(yàn)課中。除以上5個(gè)實(shí)驗(yàn)作為必修課程的拓展外，分光光度法還為學(xué)生進(jìn)行探究性課題提供了新思路，如“應(yīng)用分光光度法比較不同水果中維生素C的含量”“培養(yǎng)基中氮含量對(duì)酵母胞外蛋白水解酶活性的影響”等。

*前文受翰思科學(xué)儀器公司關(guān)注*