稀釋涂布平板法計數活菌的方法簡介

龔軍輝 王 晶

(河北省保定市第一中學 071000)

1 問題的提出

“微生物數量的測定”是2017年高考考綱中新增加的內容，同時也是教學的重難點。稀釋涂布平板法是對微生物計數的常用方法，用來統計樣品中活菌的數目。當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落來源于樣品稀釋液中的一個活菌。通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約有多少活菌。但對菌落計數的結果處理往往成為學生的易錯點。

經典例題：在從土壤中分離產脲酶細菌的實驗中，將10g土壤樣液梯度稀釋，在3個培養基平板上均接種稀釋倍數為105的土壤樣液0.1mL，培養一段時間后，平板上長出的細菌菌落數分別為42、200、256。則1g土壤樣品中的細菌數量為________個。

很多學生得出的答案為：1.66×108。同時，學生對于42這個數據如何處理存在疑問：是否需要舍棄？如果需要舍棄，標準是什么？

2 菌落計數的基本原則

2.1 教材中的相關表述 在人教版高中生物學選修1《生物技術實踐》中，對于稀釋涂布平板法計數菌落有如此的表述：為了保證結果準確，一般選擇菌落數在30～300的平板進行計數。但是，若想當然地認為42、200、256三個數據均處于30～300范圍之內，然后直接求平均值，再乘以稀釋倍數，就會得出1.66×108的錯誤結果。這也是很多學生產生錯誤的原因。

事實上，教材中的相關表述只是在說明可計數的菌落數量的適宜范圍。某一稀釋度下的3個平板中菌落數并不能簡單地直接求平均值，還應該關注稀釋度的設置以及計數結果的允許差。

2.2 稀釋度的設置及計數原則 為了確保有效活菌數的準確測定，在采用平板計數檢測中，必須設3個稀釋度且成梯度，每個梯度設3個重復[1]。測定土壤中細菌的數量，一般選用104、105和106倍的稀釋液進行平板培養；測定放線菌的數量，一般選用103、104和105倍稀釋；測定真菌的數量，一般選用102、103和104倍稀釋。

如果平板中菌落的數量太少，必然會導致計數誤差太大；反之，如果平板中菌落數量過多，會造成計數上的困難。因此，國際上通用的菌落計數的基本原則，是以平板上出現30～300個菌落數的稀釋平板為計數標準。同時要求，同一個稀釋度重復3次的平板上菌落數標準差值應小于允許差值[2]。也就是說，在平板計數檢測中，如果同一稀釋度下的3次重復菌落數雖然均處于30～300個范圍之內，但數據相差較大，就需要舍棄。

2.3 同一稀釋度下3個重復的允許差值 標準差的計算公式如下：

平板菌落數的允許差值如表1[3]。

表1 平板菌落數允許差值

由表1可知，如果平板上3次重復的菌落平均數較小，其允許的誤差就小；反之，如果菌落平均數較大，則其允許的誤差就大一些。若選一個適宜稀釋度計數，則3個重復的標準差值應小于規定的允許差值。若3個重復的標準差值大于規定的允許差值，則無法正確計數，必須重新測定。

2.4 對例題的進一步分析 根據標準差公式，對上述例題計算如下：

參照表1中菌落數的允許差值可以看出，平板菌落平均數166處于101～300之內，標準所允許差值為±≤50。但經計算得知，該稀釋度下3個平板菌落數的標準差值±111已遠超允許差值。因此，本次的計數結果不符合要求，無法正確計數，需要重做。

3 拓展

為更好地理解和熟練掌握微生物平板菌落計數的數據處理方法，提供3組示例(表2)以供參考和借鑒。

表2 平板菌落計數的數據處理示例