D型流感病毒研究進展

高曉龍，韋海濤，宋彥軍，王 躍，殷雨晴，王 林，梅 力，馮小宇

(北京市動物疫病預防控制中心，北京 102629)

流感病毒為正黏病毒科流感病毒屬的單股、負鏈、分節段RNA病毒，根據其基質蛋白(M)和核蛋白(NP)，可分為A型(influenza A virus，IAV)、B型(influenza B virus，IBV)和C型(influenza C virus，ICV)流感病毒。IAVs有18個血凝素(HA)亞型和11個神經氨酸酶(NA)亞型，其不僅能感染野鳥和家禽，還可以感染人、豬、馬、鯨等多種哺乳動物，引起感染動物的呼吸系統疾病。IBV只感染人類，主要引起人的季節性流行性感冒。ICV主要感染人類，常引起兒童的下呼吸道感染[1]，郭元吉等[2]也曾從豬體內分離到該型流感病毒。

2011年，美國首次報道從表現流感癥狀的豬體內分離到D型流感病毒(influenza D virus，IDV)，其與ICV在結構和基因組成上相似，但氨基酸相似性僅為50%左右，并且IDV抗體與IAV、IBV、ICV均無交叉反應性[3-4]。近幾年來，多個國家或地區不斷從豬、牛體內分離到IDVs，給畜牧業健康發展和公共衛生安全造成潛在威脅，作者就IDV病毒特性、流行病學、致病性、動物模型建立以及診斷和預防等方面進行如下綜述。

1 D型流感病毒特性

IDV基因組由7個片段組成，共編碼PB2、PB1、P3、NP、HEF、M(M1和CM2)、NS(NEP和NS1)等 9種蛋白[5]，并且每個基因片段非編碼區基因5′端(5′-AGCAGUAGCAAG-3′)和3′端(3′-C/UCGUAUUCGUC-5′)高度保守，幾乎與ICV一致，但3′端第5位堿基不同，IDV為腺嘌呤(adenine，A)，而ICV為胞嘧啶(cytosine，C)。這些非編碼區基因之間反向互補形成的柄狀結構在病毒粒子復制和包裝過程中發揮關鍵作用，能夠啟動mRNAs的轉錄[6]。IAV和IBV病毒粒子表面均含有2個糖蛋白，即血凝素(HA)和神經氨酸酶(NA)，而IDV同ICV一樣表面只含有1個糖蛋白，即HEF。PB2、PB1和P3共同組成多聚酶復合體，NP蛋白和多聚酶復合體組成IDV的核糖核蛋白復合體(vRNPs)。ICV和IDV的M1蛋白是其外周膜蛋白的主要組成部分，都是通過RNA剪接后翻譯而成，但剪接方式不同，ICV是在其mRNA上引入終止密碼子，而IDV是在其外顯子前面插入12個堿基；未剪接mRNA則翻譯成p42蛋白前體。p42蛋白在其內部信號肽作用下裂解產生跨膜蛋白CM2，作為RNPs進入宿主細胞內進行復制的離子通道。NS通過剪接產生NS1和NEP，NEP是一種核輸出蛋白，能介導RNPs輸出細胞核[6-7]。

與IAV、IBV相比，IDV與ICV在結構和組成上較為接近，但氨基酸相似性僅為50%左右。分子進化分析表明IDV可能與ICV來自共同的祖先，也可能是由ICV進化而來。貝葉斯分子鐘分析推斷IDV大約在1971年前后進化成2個譜系，D/OK(D/swine/Oklahoma/1334/2011)譜系和D/660(D/bovine/Oklahoma/660/2013)譜系，但2個譜系之間存在交叉反應性[6]。采用鄰近法(bootstrap值為1 000)對NCBI公布的21株IDVsHEF基因進行遺傳進化分析(圖1)發現意大利、中國流行毒株屬于D/OK譜系，而美國、墨西哥2個譜系均有流行(表1)。但D/bovine/France/2986/2012、D/bovine/Ibaraki/7768/2016、D/bovine/Miyazaki/B22/2016均位于獨立進化分支，與2個譜系進化距離較遠，因此其譜系尚不能確定。Murakami等[8]對D/bovine/Ibaraki/7768/2016采用最大似然法(bootstrap值為500)繪制其遺傳進化樹發現除M基因外，其余6個基因片段均位于獨立進化分支，因此推測其可能屬于新的進化譜系。Collin等[9]通過HEF(IDV)序列比對和分子模型比較發現212位點可能影響其抗原性。D/OK譜系毒株HEF 212位點均為賴氨酸(lysine，K)，而D/660譜系毒株212位點可能為精氨酸(arginine，R)或賴氨酸，但位于獨立進化分支的D/bovine/France/2986/2012、D/bovine/Ibaraki/7768/2016、D/bovine/Miyazaki/B22/2016的212位點為絲氨酸(serine，S)(表1)，因此HEF 212位點是否與其抗原性變化有關還有待進一步研究證實[10]。Su等[6]采用貝葉斯馬爾可夫連鎖蒙特卡洛方法(Bayesian Markov chain Monte Carlo)對HEF(IDV)分析發現HEF(IDV)每個節點平均每年進化速率為1.54×10-3(95%置信區間：5.4×10-4～2.7×10-3)，高于HEF(ICV)4.87×10-4(95%置信區間: 4.12×10-4～5.66×10-4)，表明IDV比ICV更容易發生變異進化，因此應對IDV的變異進行持續監測[6,11]。

圖1 IDV HEF基因遺傳進化分析Fig.1 Phylogenetic tree of HEF gene of IDV

表1不同IDV毒株HEF212位點氨基酸、譜系及流行地區

Table1TheaminoacidofHEF212site,lineageandinfectedareaofIDVs

毒株名稱StrainsHEF蛋白212位點氨基酸Amino acid of HEF 212 site譜系Lineage國家CountryD/swine/Oklahoma/1334/2011KD/OK譜系美國D/bovine/Kansas/1-35/2010KD/OK譜系美國D/bovine/Minnesota/729/2013KD/OK譜系美國D/bovine/Mississippi/C00046N/2014KD/OK譜系美國D/bovine/Minnesota/628/2013KD/OK譜系美國D/bovine/Shandong/Y127/2014KD/OK譜系中國D/bovine/Shandong/Y125/2014KD/OK譜系中國D/bovine/Shandong/Y217/2014KD/OK譜系中國D/swine/Italy/199724-3/2015KD/OK譜系意大利D/bovine/Italy/46484/2015KD/OK譜系意大利D/bovine/Italy/1/2014KD/OK譜系意大利D/bovine/Mexico/S62/2015KD/OK譜系墨西哥D/bovine/France/2986/2012SND法國D/bovine/Mississippi/C00014N/2014RD/660譜系美國D/bovine/Oklahoma/660/2013RD/660譜系美國D/bovine/Nebraska/9-5/2012RD/660譜系美國D/bovine/Texas/3-13/2011KD/660譜系美國D/bovine/Kansas/13-21/2012RD/660譜系美國D/bovine/Mexico/S56/2015RD/660譜系墨西哥D/bovine/Ibaraki/7768/2016SND日本D/bovine/Miyazaki/B22/2016SND日本

ND表示不能確定毒株譜系；K即賴氨酸；R即精氨酸；S即絲氨酸

ND indicates lineage not determined；K is lysine; R is arginine; S is serine

流感病毒表面糖蛋白在其宿主感染和致病性方面具有重要作用，因此目前研究較多的是IDV的HEF蛋白。我國學者Song等[12]對IDV表面唯一糖蛋白HEF生物學特性研究發現其具有與HEF(ICV)相似的受體識別、受體破壞及膜融合等功能。HEF由HEF1和HEF2兩個亞基組成，分為受體結合區(receptor binding domain，R)、酯酶活性區(esterase domain，E，由E1、E′和E2三個亞功能區組成)以及融合活性區(fusion domain，F，分為F1、F2和F3三個亞功能區)。通過比較分析IDV和ICV HEF氨基酸序列及2.4 ?分辨率的三維結構，發現它們的整體結構及亞功能區結構和功能高度相似，其中E最保守，與ICV序列一致性分別為66.7%、68.8% 和56.6%(E1、E′、E2)，主鏈C原子疊合的均方根偏差(RMSD)分別為0.396 ?、0.390 ?和 0.435 ?；R序列一致性為46.3%，RMSD為0.642 ? ；F序列一致性分別為42.1%、41.2%、56.8%(F1、F2、F3)，RMSD分別為0.567 ?、0.817 ?、1.445 ?，表明這兩個蛋白的受體結合特性、受體破壞特性以及膜融合功能具有較高的相似性。由于F3含有融合肽，雖然其序列一致性較高，但RMSD為1.445 ?，所以推測IDV的膜融合功能可能與ICV有一定差異[12]。

IAVs通過特異結合唾液酸α2,3-半乳糖(禽源)或唾液酸α2,6-半乳糖(人源)而感染禽或人，部分亞型(如H1N1、H5N1、H7N9等)具有雙受體結合特性，既可感染人也可感染禽。Song等[12]利用聚糖微陣列方法證實IDV能特異結合9-O-乙酰唾液酸(9-O-Ac-Sia)，并且無論是α2,3還是α2,6連接的糖苷鍵9-O-乙酰唾液酸受體都能發生特異結合。與ICV不同的是，IDV仍能與C5乙酰化或糖基化修飾的9-O-Ac-Sia結合。通過解析HEF蛋白-受體復合物2.2 ?分辨率三維晶體結構發現IDV受體結合區域與ICV相似，靠近HEF1球狀頭部的頂端，位于170-環、190-環、230-螺旋、270-環以及5個氨基酸(F127、W185、Y231、F229以及F297)形成的一個淺腔內。不同的是HEF(ICV)帶負電荷的D269位點和帶正電荷K235位點形成鹽橋促使270-環和230-螺旋相連形成封閉的受體結合區域，而IDV的T239和A273均為不帶電荷氨基酸，因此270-環和230-螺旋沒有連接，而是形成一個特征性的開放通道，所以IDV能結合不同宿主受體的多種多聚糖鏈，這可能與其宿主譜較為廣泛有關[6, 10]。另外一個重要特征就是HEF(IDV)的127位氨基酸與IBV(第95位)相同，都為苯丙氨酸(phenylalanine，F)，而HEF(ICV，第127位)和HA(IAV，第98位)為酪氨酸(tyrosine，Y)。雖然F127不能與9-O-Ac-Sia的乙酰基形成氫鍵，但是C4和T171之間至少可以形成2個氫鍵，有助于穩定受體構像避免平移或旋轉，進而增加病毒與受體的親和力[12]。

IAV和IBV的NA具有受體破壞特性,能夠裂解末端唾液酸使其與糖蛋白或糖脂脫離，釋放病毒粒子[13]；而ICV和IDV主要是通過其HEF介導病毒粒子的進入和釋放。HEF不僅能夠結合特異受體，還具有乙酰酯酶活性，水解受體9-O-Ac-Sia C9連接的乙酰基團使病毒粒子和受體解離。由S57、D356和H359組成的催化三聯體是HEF受體裂解活性的關鍵位點，并且這三個位點高度保守，ICV和IDV完全一致。Song等[12]發現隨著溫度的降低，HEF脂酶活性也逐漸降低，但是在4 ℃條件下，仍具有較強的脂酶活性[10, 12]。

HA或HEF在體內蛋白酶作用下裂解是流感病毒入侵的第一步，ICV和IDV的HEF都只含有1個堿性裂解位點，呈低致病性分子特征，在蛋白酶作用下裂解為HEF1和HEF2兩個蛋白亞基，序列分析表明ICV和IDV HEF2融合肽N末端前8個氨基酸完全一致(IFGIDDLI)，并且都暴露在表面，而IAV和IBV HA2融合肽N末端插入一個負電腔洞中。融合蛋白的裸露可能與其親脂性有關[10,12-14]。

IAV熱穩定性和耐酸能力對其跨種傳播能力具有重要作用。Yu等[15]發現IDV較IAV、IBV、ICV具有較強的熱穩定性和酸穩定性，53 ℃加熱2 h 或pH3.0環境下作用0.5 h IDV仍具有感染性，而其他流感病毒已完全失去感染活性。不同的細胞、組織甚至是動物體內pH不同，因此推測IDV可能會具有較廣泛的組織嗜性和宿主感染性。反向遺傳學研究表明HEF蛋白對IDV的熱穩定性和耐酸能力起到關鍵作用，所以應對HEF蛋白與熱穩定性、耐酸等特性之間的分子機制進一步研究，防止其發生變異引起跨種傳播。

2 D型流感病毒流行病學

IAVs以野鳥為自然貯存宿主，IBVs和ICVs以人為自然宿主，而目前普遍認為IDV的自然貯存宿主是牛，可以感染奶牛、肉牛、水牛以及黃牛等多種牛，6月齡犢牛最易感，主要引起牛呼吸系統疾病。豬、山羊、綿羊甚至人均有IDV陽性或抗體陽性的報道[6,16-19]。實驗條件下，IDV也可以感染豚鼠、雪貂等動物。IDV可以在雪貂、豚鼠或牛群中發生接觸傳播，空氣傳播能力有限，因此推測IDV的傳播方式同其他流感病毒一樣，主要通過水平接觸傳播[3, 20-21]。

2011年，IDV首次在美國俄克拉何馬州分離到，隨后美國的堪薩斯州、內布拉斯加州、得克薩斯州、明尼蘇達州、密西西比州等多個州牛群中檢測并分離到IDVs。根據IDV遺傳進化關系，目前IDV主要分為D/OK和D/660兩個譜系，但存在一定的交叉反應性。Luo等[19]挑選不同譜系的D/bovine/Mississippi/C00013N/2014 (D/13N)和D/bovine/Mississippi/C00046N/2014 (D/46N)作為檢測抗原，對采集于2003—2004年內布拉斯加州40個養殖場的293份牛血清樣品中IDV抗體回溯性調查，發現240份血清樣品IDV血凝抑制抗體陽性(效價大于或等于1∶40)，陽性率高達81.9%，其中有3份 血清樣品只對D/13N呈陽性，5份樣品只對D/46N 陽性，同時發現對D/13N和D/46N血凝抑制陽性的113份樣品的血凝抑制效價不同(log2平均值相差1.09±0.29)。以上監測結果證明IDV早在2003年已經在美國出現，并且IDV在流行過程中發生了抗原性變異，形成2個抗原群，但存在一定的交叉反應性。

White等[18]以D/bovine/Kansas/1-35/2010作為檢測抗原對佛羅里達州35名健康的牛場工作人員IDV抗體進行檢測，發現超過94%的牛場工作人員IDV抗體陽性(效價大于或等于1∶40)，其中32人血凝抑制(haemagglutination inhibition，HI)抗體陽性，效價為1∶40～1∶160；34人中和抗體陽性，效價為1∶40～1∶320，這些人曾患過發熱性疾病或有病牛、病豬接觸史。White等[18]對當地4名普通人(近10年沒有牛接觸史)的IDV血清學調查發現有3人HI抗體陽性，效價為1∶40～1∶80；2人中和抗體陽性，效價為1∶40～1∶80。Eckard[22]利用D/swine/Oklahoma/1334/2011 (D/OK)作為檢測抗原對居住在奶牛養殖場附近的高危暴露人群的741份血清中IDV的HI抗體進行檢測，發現僅有8人 呈HI抗體弱陽性(效價大于等于1∶40)，陽性率約為1%。以上血清學結果表明IDV也可以感染人，尤其是牛場或豬場工作人員為易感人群，但其不會引發人致命性疾病。

除美國以外，法國[23]、意大利[24-25]、愛爾蘭、日本[8,26]、中國[27]、摩洛哥、貝寧、多哥以及肯尼亞[28]等多個國家或地區也有過IDV感染的相關報道。Salem等[28]利用血凝抑制方法檢測肯尼亞地區單峰駝血清樣品中的流感病毒抗體，發現其與IDV(D/bovine/Nebraska/9-5/2012)和ICV(C/Victoria/1/11)結合后都能抑制紅細胞凝集。進一步研究發現血清經過四個凝集單位的ICV吸附處理后， IDV抗體滴度下降超過2個滴度，陽性率由99%降至8.2%，而經IDV吸附處理后，ICV抗體陽性率也由94%下降為9%。因此推測IDV可能會感染單峰駝并且與ICV發生抗體交叉反應，但是相關感染機制以及感染駱駝后與ICV發生的抗體交叉反應性還有待進一步研究。

3 D型流感病毒致病性及動物模型研究

研究發現IDV感染是臨床常見牛呼吸道疾病(BRD)的主要原因[6]。Ferguson等[20]將牛源IDV(D/bovine/Mississippi/C00046N/2014)人工感染犢牛后，能夠引起感染犢牛的氣管炎癥，并出現干咳、流鼻涕等輕微呼吸道癥狀，證明IDV比較容易感染牛群且發生接觸傳播。為進一步研究IDV傳播能力，Ferguson等[20]通過人工模擬自然狀態下流感傳播途徑，利用2只雪貂接觸感染牛群鼻分泌液污染物后并未檢測到病毒，血清IDV抗體陰性。因此，雖然IDV能夠感染并引起牛群的輕微呼吸系統疾病，但其通過排泄污染物傳染給人的風險仍較低。

Hause等[3]將分離到的首株IDV(D/OK)人工感染雪貂和豬，評價其哺乳動物致病性和傳播能力。D/OK分離株感染雪貂后未引起流感的臨床癥狀和病理學變化，而且只能從感染組和接觸組雪貂鼻洗液中檢測到病毒，上呼吸道、下呼吸道、肺、小腸、肝、脾等組織均檢測不到病毒，空氣傳播組雪貂雖未檢測到IDV，但1只雪貂IDV抗體轉陽，表明IDV不僅能感染雪貂，并且存在水平接觸傳播的可能性，同時具有有限的飛沫傳播能力。同樣，D/OK感染豬后也觀察不到流感臨床癥狀和病理學變化，但是豬感染后能通過鼻洗液持續排毒。與IAV相比，雖然IDV在雪貂和豬體內尤其是上呼吸道感染復制能力較低，但其有限的哺乳動物間接觸傳播能力給人類健康造成巨大的潛在威脅。

小鼠、豚鼠、雪貂及非人靈長動物等哺乳動物廣泛用于A型流感病毒感染機制和宿主免疫反應等相關研究。IDV雖然能感染雪貂，但在雪貂體內復制能力有限。豚鼠屬于哺乳綱動物，其氣道高反應性和支氣管淋巴組織等均與人類相似，并且與豬、雪貂相比具有體型小、容易操作、價格低廉等優勢，因此Sreenivasan等[21]利用豚鼠構建IDV哺乳動物感染模型，IDV在豚鼠鼻甲骨、肺、呼吸道等組織內有效復制，并能在豚鼠間傳播。IDV哺乳動物感染模型的建立有助于IDV感染和致病性等相關分子生物學特性研究。

4 D型流感病毒診斷和預防技術研究

病毒分離培養是流感病毒診斷的金標準，Hause等[3]發現IDV的細胞嗜性較為廣泛，能在豬睪丸細胞(ST)、肺癌細胞(A549)、犬腎細胞(MDCK)、非洲綠猴腎細胞(Marc-145)、人直腸癌細胞(HRT-18G)、乳倉鼠腎細胞(BHK-21)、豬腎細胞(PK-15)等多種細胞中生長繁殖，但在BHK-21和PK-15細胞中復制能力較差。因此IDV的診斷可以采用細胞分離法。

由于流感病毒其表面蛋白糖蛋白能與雞紅細胞發生凝集作用，因此，IDV血清學診斷主要采用血凝和血凝抑制方法，同時也可以采用酶聯免疫吸附試驗、補體結合試驗等方法。

聚合酶鏈式反應(PCR)具有快速、準確、敏感等特點，因此IDV鑒別診斷可以采用此方法。研究表明流感病毒基因組中PB1基因序列最為保守。因此，目前大部分是基于IDV的PB1基因建立PCR檢測方法[29]。Hause等[3]根據D/swine/1334/Oklahoma/2011分離株PB1基因(1 420～1 555 bp區間)設計引物，建立了IDV Taqman熒光定量PCR檢測方法。Faccini等[30]根據GenBank公布的所有IDV分離株序列的PB1基因(14株)保守區域(在1 215～1 323 bp)設計引物，建立了兩步法熒光定量PCR。

由于IDV發現時間較短，所以目前尚未有商品化疫苗和特異性治療藥物。Hause等[31]利用0.1%β-丙內酯將D/bovine/Kansas/162655/2012滅活后添加30% Emulsigen佐劑制備全病毒滅活疫苗，免疫牛后雖然能顯著降低IDV排毒量(減少1～2 TCID50·mL-1)，但不能對D/bovine/Kansas/162655/2012的攻擊起到100%保護作用。因此建議應用廣譜抗病毒藥物輔以對癥療法預防和治療IDV感染。

5 展 望

近幾年來，IAVs(H1N1、H5N1、H5N8、H7N9等)和IBVs肆虐全球，尤其是2017年年初流感呈高發態勢，給養殖業造成巨大損失的同時嚴重影響著人群健康。新發現的D型流感病毒感染宿主范圍較廣，不但可以感染豬、牛、羊、駱駝等，還能感染人，尤其是牛場工作人員為高危人群。雖然IDV致病力不高且哺乳動物間傳播能力有限，但是其可能會通過呼吸道表面的毛細血管內皮細胞進入宿主循環系統，引起病毒血癥，給人類健康造成嚴重威脅[27]。多項研究發現我國山東、廣州等多地區存在IDV感染情況，且均屬于D/OK譜系[17,27]。IDV在我國是一直存在還是從他國傳入，通過何種方式傳入我國，這些問題仍有待研究。鑒于當前IDV流行范圍不斷擴大，并且在流行過程中較ICV容易發生變異，加之熱穩定性好、耐酸，在自然環境中容易存活，因此應加強并且持續進行IDV流行病學調查，尤其是人群中IDV流行情況，同時對其遺傳進化規律、致病分子機制、診斷方法以及疫苗研發等相關問題進一步研究。