噬菌體展示技術(shù)在單克隆人源單鏈抗體領(lǐng)域的研究進(jìn)展

夏 靜

(江蘇省南京師范大學(xué)附屬實(shí)驗(yàn)學(xué)校 210000)

1 傳統(tǒng)單克隆抗體制備技術(shù)

1.1 抗體 抗體是一類(lèi)能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白。其單體結(jié)構(gòu)呈“Y”字型，含有四條多肽鏈。其中，分子量較大的兩條鏈稱(chēng)為重鏈，而分子量較小的兩條鏈稱(chēng)為輕鏈。重鏈和輕鏈靠近N端的氨基酸序列變化很大，稱(chēng)為可變區(qū)(V)，靠近C端的氨基酸序列相對(duì)穩(wěn)定，稱(chēng)為恒定區(qū)(C)[1]。抗體的特異性識(shí)別和抗原結(jié)合能力主要取決于V區(qū)的氨基酸序列。

1.2 抗原決定簇 抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團(tuán)稱(chēng)為抗原表位或抗原決定簇。表位代表了抗原分子上的一個(gè)免疫活性區(qū)域，而一個(gè)抗原大分子往往具有多個(gè)不同的抗原表位。在最初依靠免疫小鼠、兔、羊等動(dòng)物獲得的抗血清，其主要免疫活性成分是多克隆抗體，即由多個(gè)漿細(xì)胞克隆產(chǎn)生的、針對(duì)多種抗原表位的抗體。

1.3 單克隆抗體 制備特異性抗體的理想方法是獲得只針對(duì)單一表位的B細(xì)胞克隆，并在體外擴(kuò)增，使其分泌抗體，然而漿細(xì)胞在體外培養(yǎng)壽命較短。1975年，Kohler和Milstein建立的體外細(xì)胞融合技術(shù)，獲得了免疫小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合的雜交瘤細(xì)胞，克服了以上缺陷。雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，在結(jié)構(gòu)和組成上高度均一(含有完全相同的重鏈和輕鏈)，抗原特異性一致，易于體外大量制備和純化。因此，單克隆抗體具有純度高、特異性強(qiáng)、效價(jià)高等特性，已廣泛應(yīng)用于疾病的診斷、特異性抗原的鑒定、生物靶向藥物的制備等領(lǐng)域[2]。

然而，傳統(tǒng)單克隆抗體技術(shù)制備的抗體是小鼠源性抗體，用于人體進(jìn)行治療時(shí)，將作為抗原性蛋白引起人抗小鼠抗體反應(yīng)，不僅使治療性單克隆抗體半衰期變短，療效減弱，有時(shí)還會(huì)引起嚴(yán)重的不良反應(yīng)[2]。

2 噬菌體展示技術(shù)在人源單克隆抗體領(lǐng)域的運(yùn)用

隨著重組DNA技術(shù)的發(fā)展，包括噬菌體展示技術(shù)在內(nèi)的各種抗體人源化基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，單克隆抗體藥物經(jīng)歷了人鼠嵌合單抗、人源化單抗階段，使全人源單抗(其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的，去除免疫原性和毒副作用)的產(chǎn)生成為可能。2003年，針對(duì)人腫瘤壞死因子(TNF)的第一個(gè)全人源抗體阿達(dá)木單抗(Adalimumab)上市，可用于治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等疾病。

2.1 何謂噬菌體展示技術(shù) 噬菌體展示技術(shù)是將目的基因與編碼噬菌體衣殼蛋白基因相連，使多肽或蛋白質(zhì)與其衣殼蛋白氨基端融合并展示在噬菌體表面，被展示的多肽或蛋白可保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。在此基礎(chǔ)上建立的噬菌體展示抗體庫(kù)，由于在重組載體構(gòu)建中，不同DNA序列的重鏈基因與不同DNA序列的輕鏈基因隨機(jī)組合，可以形成比實(shí)體B細(xì)胞內(nèi)還要多的組合形式，其篩選范圍較雜交瘤技術(shù)擴(kuò)大了幾千到幾百萬(wàn)甚至幾億倍。因此，理論上可以從文庫(kù)中篩選到針對(duì)任何抗原的高親和力人源抗體，并且制備周期相對(duì)傳統(tǒng)單抗大為縮短。

2.2 常用的噬菌體類(lèi)型 噬菌體展示技術(shù)常用的噬菌體類(lèi)型為：?jiǎn)捂溄z狀噬菌體(如M13噬菌體)、λ噬菌體和T4噬菌體，目前在抗體領(lǐng)域應(yīng)用最多的是M13噬菌體。M13噬菌體是一種絲狀噬菌體，內(nèi)有一個(gè)環(huán)狀單鏈DNA分子，長(zhǎng)6407個(gè)核苷酸，基因組可編碼3類(lèi)蛋白質(zhì)，即復(fù)制蛋白、形態(tài)發(fā)生蛋白和結(jié)構(gòu)蛋白。

2.3 噬菌體展示技術(shù)及其篩選流程 在基因工程抗體的研究中，研究者常將抗體片斷與M13噬菌體尾部的結(jié)構(gòu)蛋白——pⅢ融合表達(dá)而展示于噬菌體表面(圖1)，通常抗體在噬菌體上呈3～5個(gè)拷貝展示。由于噬菌體基因組大小的限制，插入外源基因的大小最多1500bp。因此，目前以含有抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的單鏈(single chain fragment variable， scFv)抗體的研究最為常見(jiàn)。scFv抗體的相對(duì)分子質(zhì)量約為25kDa，與完整抗體(分子量約為150kDa)相比，具有體積小、穿透性好等特點(diǎn)，能夠到達(dá)深層靶組織，在疾病治療應(yīng)用方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。同時(shí)由于其分子量小，可以在人體內(nèi)較快被降解代謝，故毒副作用較小。

圖1 M13噬菌體

噬菌體展示技術(shù)篩選抗體的流程為：①將106～1011scFv-M13噬菌體克隆與固相化的抗原結(jié)合；②洗滌去除低親和力的scFv-M13噬菌體克隆；③洗脫與抗原特異性結(jié)合的高親和scFv-M13噬菌體克隆；④高親和噬菌體克隆侵染宿主菌；⑤擴(kuò)增高親和scFv-M13噬菌體克隆。以上5步驟需循環(huán)3～5次以獲得高親和力的scFv單抗[3]。

2.4 建立噬菌體單鏈抗體文庫(kù) 噬菌體單鏈抗體文庫(kù)是將通過(guò)PCR技術(shù)克隆出的全套人抗體重鏈和輕鏈V區(qū)基因，在噬菌體表面進(jìn)行展示。在構(gòu)建噬菌體人源scFv抗體文庫(kù)時(shí)，首先需要從人B淋巴細(xì)胞中提取RNA，并以此逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，接著用特異性引物分別擴(kuò)增重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)基因，通過(guò)重疊延伸PCR技術(shù)(SOE-PCR)將兩段基因以一段連接序列相連，獲得scFv基因。將scFv與噬菌體載體經(jīng)過(guò)酶切、酶連后，獲得重組噬菌體載體，侵染宿主菌擴(kuò)增后即獲得噬菌體scFv文庫(kù)(圖2)[4]。scFv在體外適宜的條件下，可以自發(fā)折疊成天然構(gòu)象，保持重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)的特異性結(jié)合能力。

圖2 噬菌體展示scFv抗體文庫(kù)的重組載體構(gòu)建流程

2.5 scFv抗體的應(yīng)用 目前已有大量關(guān)于scFv抗體應(yīng)用于人體疾病治療及診斷領(lǐng)域的研究報(bào)道。例如，馬帕木單抗(Mapatumumab)是現(xiàn)今臨床篩查和治療DR4分子陽(yáng)性腫瘤的有力武器，在單獨(dú)運(yùn)用以及與化療藥物聯(lián)用的臨床試驗(yàn)中都取得了良好療效；在淋巴癌及多種實(shí)體瘤的臨床研究中，已證明抗DR-5的Tigatuzumab其毒副作用小，穿透性強(qiáng)，治療組相比對(duì)照組有明顯延長(zhǎng)患者生存期的效果[5]。治療性單克隆除scFv抗體外，與其具有相似功效的還包括 Conatumumab(AMG 655)、Lexatumumab和Drozitumab等[6]。