多肉植物表皮細胞幾種制片方法的比較

王 穎 許 藝 陳秉初 陳文榮

(浙江師范大學化學與生命科學學院 金華 321004)

中學生物學實驗中，洋蔥因取材方便，制片容易，往往作為植物細胞結構觀察的最佳材料，為了使學生認識到植物細胞形狀的多樣性，通過對植物細胞的觀察能夠直觀地獲得更多生物學知識，并增加對植物表皮細胞中氣孔器等結構的充分認識，觀察除洋蔥鱗葉以外的其他植物的表皮細胞能夠豐富學生的知識面，提升比較和分析材料的能力。因此，本文選用景天科的玉蝶(Echeveriapumilavar.glauca)為材料研究多肉植物的表皮細胞形態，試圖激發學生對生物學的興趣，加強對生命本質的探索，拓寬學生的視野。同時，比較了直接剝離法、煮沸剝離法、刮片法、過氧乙酸離析法、次氯酸鈉離析法、FAA固定法和瓊脂糖印跡法等7種方法操作難易程度和制片效果，旨在為多肉植物選擇一種適于中學生物學實驗課堂的制片方法，將多肉植物表皮細胞的觀察引進中學生物學實驗課堂中。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗材料選取常見的多肉植物二年生玉蝶為材料，采摘自內向外第8～9圈玉蝶葉。將采集的玉蝶葉片取中間部分截取1cm×1cm的材料進行制片，制片完成后在光學顯微鏡下觀察并導入DP Controller系統拍照。

1.2 方法 具體如下：

1.2.1 物理法 包含直接剝離法、煮沸剝離法、刮片法：

(1) 直接剝離法 用小鑷子直接撕取葉片的下表皮放在載玻片上染色4～5min，蓋上蓋玻片后鏡檢。

(2) 煮沸剝離法 將截取的玉蝶葉片在沸水中煮6～8min，取出材料，用小鑷子撕取葉片的下表皮放在載玻片上染色4～5min，蓋上蓋玻片后鏡檢。

(3) 刮片法 將透明膠帶粘在玉蝶葉片材料表皮上，用刀片刮去上表皮及葉肉，留下下表皮，然后將粘有玉蝶下表皮的膠帶粘貼在載玻片上，不用蓋玻片直接在顯微鏡下觀察。

1.2.2 腐蝕離析法 包含過氧乙酸離析法、次氯酸鈉離析法：

(1) 過氧乙酸離析法 將截取的玉蝶葉片浸泡在等量的30%的過氧化氫溶液和醋酸溶液中，在60℃恒溫水浴鍋中放置3h，漂洗干凈后移入盛有蒸餾水的培養皿中，撕取下表皮，放在蓋玻片上用1%的番紅染色4～5min，蓋上蓋玻片后鏡檢。

(2) 次氯酸鈉離析法 將截取的玉蝶葉片置于50% NaClO溶液中浸泡至葉片發白后取出，蒸餾水沖洗后撕取下表皮，1%的番紅染色4～5min，蓋上蓋玻片后鏡檢。

1.2.3 固定法 包含FAA固定法、瓊脂糖印跡法：

(1) FAA固定法 量取90mL 50%乙醇，5mL冰醋酸和5mL 37%～40%甲醛溶液，配制成FAA固定液。將截取的玉蝶葉片置于FAA固定液中浸泡24h，蒸餾水沖洗后撕取下表皮，1%的番紅染色4～5min，蓋上蓋玻片后鏡檢。

(2) 瓊脂糖印跡法 將截取的玉蝶葉片置于FAA固定液中24h。稱取1.2g瓊脂糖溶于80mL ddH2O中，滴入5～6滴1%番紅染液使瓊脂糖著色，反復煮沸至瓊脂糖完全溶解。取1張濾紙，粘上雙面膠，將材料吸干水分后展平在雙面膠上，放入培養皿中。將冷卻至50℃～60℃的瓊脂糖倒入培養皿中至淹沒材料，靜置待其凝固。將培養皿倒置取出瓊脂糖凝膠，切取含拓痕的凝膠，將拓痕面朝上放置在載玻片上，鏡檢。

2 結果與分析

2.1 玉蝶表皮顯微形態特征 玉蝶上下表皮僅有一層細胞，包括氣孔器和形狀不規則的表皮細胞。氣孔器屬于不等型，由保衛細胞、副衛細胞和氣孔共同組成。其中有3個大小不同的副衛細胞圍繞著保衛細胞，2個保衛細胞中間存在橢圓形或圓形的氣孔。表皮細胞形狀比較規則，近橢圓形或近圓形，垂周壁直，弧形或略彎曲，偶爾呈淺波形，細胞之間相互嵌合沒有間隙。玉蝶上、下表皮氣孔的數目近乎相等，均無表皮毛等附屬物。

2.2 三種物理法制備裝片質量比較 比較?圖1可知，直接剝離法制備裝片質量較高，表皮細胞輪廓清晰，細胞核明顯居于細胞中央，能夠看到部分微張的氣孔，染色均勻度不佳；煮沸剝離法制備裝片的表皮細胞輪廓和細胞核清晰度一般，氣孔較直接剝離法明顯，但染色效果不如直接剝離法；刮片法制備裝片清晰度較好，但表皮細胞輪廓較厚，不能觀察到細胞核和氣孔。

2.3 兩種腐蝕離析法制備裝片質量比較 兩種腐蝕離析法制備的表皮裝片均獲得較好效果，氣孔都比較明顯(?圖2)，其中次氯酸鈉離析法制備裝片的表皮細胞輪廓十分清晰，可觀察到細胞核，這也是本研究中唯一能夠看到保衛細胞中葉綠體結構的制片方法；而過氧乙酸離析法制備裝片表皮細胞遭到破壞，無法辨認細胞核，裝片整體清晰度低。由于化學試劑具有腐蝕性、強氧化性等特點，腐蝕離析法的染色效果都一般。

2.4 兩種固定法制備裝片質量比較 經由固定液處理過的裝片都有清晰的表皮細胞輪廓(?圖3)，FAA固定法制備裝片染色均勻，氣孔明顯，表皮細胞的細胞核位于細胞中央，保衛細胞的細胞核貼近細胞壁，是裝片清晰度最高的制片方法；瓊脂糖印跡法制備裝片也能夠看到明顯的氣孔結構，但無法觀察到細胞核、葉綠體等其他結構，染色較淺但均勻，建議增加番紅溶液的使用量。

2.5 不同制片方法的制片過程比較 從整個制片時長來看，FAA固定法和瓊脂糖印跡法耗時最長，腐蝕離析法也都需要較長時間的前期準備，物理法耗時皆不超過20min(表1)。制片操作難度以刮片法最甚，在實驗操作時，刀片的力度控制不當都有可能造成葉肉細胞未刮干凈或者將需要觀察的表皮細胞刮破等情況，此外，由于透明膠帶粘貼不當極易產生氣泡。瓊脂糖印跡法涉及工序比較繁瑣，在將含拓痕的凝膠切取下來放置在載玻片上的過程中，凝膠比較柔軟，容易因為拉扯而變形，使表皮細胞形狀也發生變形，真實性降低。其余5種方法操作難度較低，由于玉蝶表皮細胞僅1層，且容易與葉肉細胞分離，用鑷子撕取時成功率較高，難點主要在溶液浸泡時間和染色時間的控制上。另外需要注意的是： 使用離析法制備裝片時，若不用蒸餾水洗凈葉片表面殘留的溶液，容易造成染色不均或染色過淺等情況，尤其在次氯酸鈉離析法中此現象更加明顯。離析法由于材料具有腐蝕性、易揮發等特點，安全性較低；直接剝離法無需煮沸、刀刮和化學試劑處理，對學生的傷害最小，其余方法安全性一般。

表1 7種制片方法制片過程與裝片質量比較

3 結論與討論

多肉植物與洋蔥長方形的表皮細胞相比，形狀更加多樣，其“花環狀”的氣孔器也有別于洋蔥“腎臟形”的氣孔器，同時多肉植物更易獲得布滿氣孔的表皮結構，多樣的細胞結構和多肉植物的熱門程度能夠激起學生對生物學的較高興趣。除此之外，多肉植物本身表皮容易剝離，葉片數目眾多，適量摘取葉片對植物影響較小，且在家庭中普遍種殖，容易獲取。比較這7種不同制片方法的制片難度和質量認為： 直接剝離法和FAA固定法比較適用于中學生物學實驗課堂，其操作快速而簡便，且較其他方法更為安全。綜合各方面的考量，FAA固定法制備裝片清晰度高，能觀察到清晰的表皮細胞輪廓，細胞核以及張開的氣孔，雖然其前期處理時間較長，但其時間周期正好為24h，方便教師在前一日將植物材料浸泡在FAA溶液中。由此可見，簡易的操作方法和較高的裝片質量使得FAA固定法成為適于中學生物學實驗課堂中處理玉蝶表皮細胞的最佳方法。但該方法也有其不足之處，即無法觀察到保衛細胞中的葉綠體。若課堂需要，可由教師利用次氯酸鈉離析法制備裝片，既讓學生觀察到了葉綠體結構，又增加了課堂互動性。若教師時間有限，可采用直接剝離法。因此，用FAA固定法來制備多肉植物表皮裝片，具有較高的可行性，值得推廣。