諾鄧火腿抗氧化肽的分離純化與鑒定

吳寶森，王桂瑛*，谷大海，程志斌，王雪峰，徐志強，范江平，普岳紅，廖國周*

1 (云南農業大學 食品科學技術學院，云南 昆明, 650201) 2(云南農業大學，云南省畜產品加工工程技術研究中心，云南 昆明, 650201)

諾鄧火腿是云南的名特產，因配料獨特，制作精細，質優而味美，切口肉色嫩紅，具有濃郁的鄉土風味和白族臘制品的風格而聞名。諾鄧火腿中的蛋白質在發酵過程中受組織內源性酶和微生物酶的作用，降解產生小分子肽類，研究發現發酵肉制品中蛋白質降解生成的多肽具有抗氧化活性[1]。天然抗氧化肽具有清除重金屬，降低細胞自氧化速率，防止脂肪過氧化，減少自由基的生成等作用[2]。目前對諾鄧火腿抗氧化肽的研究很少，對抗氧化肽的分離純化與鑒定尚無報道。

本試驗通過提取諾鄧火腿抗氧化肽，經Sephadex G-25凝膠色譜和Sephadex G-15凝膠色譜對諾鄧火腿抗氧化肽進行分離純化，通過多種體外抗氧化試驗(清除·OH、清除DPPH自由基、螯合Fe2+)研究其抗氧化活性，最后對抗氧化活性最強的諾鄧火腿抗氧化肽使用MALDI-TOF-MS進行測序鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

以8條諾鄧當地黑毛土豬的后腿(日齡相似、腿重相近)為原料，按傳統加工工藝加工諾鄧火腿，在云南省大理白族自治州云龍縣諾鄧火腿食品廠進行加工，加工時長2年，加工時間：2013年12月至2015年12月。隨機選取5條諾鄧火腿，并取股二頭肌肉樣，真空包裝，置于-80 ℃冰箱保存。

1.2 設備

冷凍離心機(湖南可成儀器設備有限公司；H2-16KR)；高速離心機(Thermo Scientific，Pico 17 Centrifuge)；勻漿機(德國IKA，T25)；冷凍干燥機(Hanil，Cleanvac8)；紫外分光光度計(北京譜析通用儀器有限責任公司，TU-1950)；磁力攪拌器(江蘇金壇醫療儀器廠，HJ-3)；自動部分收集器(上海青浦滬西儀器廠，BSZ-100)；恒流泵(上海青浦滬西儀器廠，HL-2)；移液器(吉爾森，Eppendorf)；質譜(AB SCIEX，MALDI-TOF4800)；液相(Thermo Scientific，Ultimate 3000)；NanoDrop(Thermo Scientific，2000C)。

1.3 實驗方法

1.3.1 諾鄧火腿抗氧化肽的提取及多肽含量測定

參考ZHU等[3]的方法，適當調整；取諾鄧火腿股二頭肌部位肉樣，去除瘦肉中肌腱及肌膜，切碎斬勻后稱取30 g，加入100 mL磷酸鹽緩沖液( 0.2 mol/L，pH 7.2) ；冰浴勻漿3次，轉速24 000 r/min，每次10 s，中間間歇10 s。勻漿液于4 ℃下靜置2 h后，4 ℃、10 000 r/min冷凍離心10 min；取上清液，用紗布過濾掉上浮的油脂，再加入3倍體積的體積分數40%的乙醇，4 ℃下靜置12 h后，4 ℃、10 000 r/min離心10 min。然后取上清液置100 Da透析袋中，在4 ℃環境中，置于磁力攪拌器上，透析4 h，去除小分子物質。最后冷凍干燥，即為諾鄧火腿抗氧化肽粗肽粉，-80 ℃冰箱中保存備用。

多肽含量的測定：參考CHURCH等[4]的方法，稍作調整。鄰苯二甲醛混合試劑的配制：取40 mg鄰苯二甲醛溶解于1 mL甲醇中，依次加入25 mL四硼酸鈉溶液(0.1 mol/L) 、2.5 mL SDS(質量分數20%) 和100 μL β-巰基乙醇，最后用去離子水將溶液定容至50 mL；為保證試驗數據準確性，試劑現用現配。取100 μL的粗肽溶液(1 mg/mL)與2.0 mL鄰苯二甲醛混合試劑，混勻，室溫下孵育2 min。測定反應液在340 nm波長處的吸光值。用胰酪蛋白胨作為標準蛋白配制梯度溶液，制定標準曲線，換算諾鄧火腿粗肽粉中的多肽含量。

1.3.2 諾鄧火腿抗氧化肽的抗氧化活性測定

諾鄧火腿抗氧化肽·OH清除率測定：根據LI等[5]的方法，將抗氧化肽配成質量濃度為1.0 mg/mL溶液。樣品管：取0.6 mL鄰二氮菲溶液(5 mmol/L)加入0.4 mL磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L、pH 7.2)混勻后，加0.6 mL樣品溶液及0.6 mL EDTA(15 mmol/L)，再次混勻，之后加入0.6 mL FeSO4溶液(5 mmol/L)，充分混勻后加入0.8 mL H2O2(0.1%)，搖勻后于37 ℃保溫1 h，測536 nm波長處吸光度記A樣品；損傷管：去離子水代替樣品，其余步驟同樣品管，測吸光度計記A損傷；未損傷管：分別以去離子水代替樣品和H2O2，其余步驟同樣品管，測吸光度計記A未損傷。同時配制相同濃度的谷胱甘肽溶液，相同操作下測定GSH清除·OH的效果。·OH清除率計算：

(1)

諾鄧火腿抗氧化肽對DPPH自由基清除率測定：參考WU等[6]的方法，將諾鄧火腿抗氧化肽配成質量濃度為1.0 mg/mL的溶液。將2 mL DPPH自由基溶液(0.2 mmol/L，溶于體積分數95%乙醇)置于試管中，加入2 mL樣品溶液，振蕩混勻，室溫避光放置30 min后，在517 nm波長處測樣品的吸光度，以2 mL 95%乙醇加入2 mL樣品為空白，2 mL DPPH自由基溶液加上2 mL 95%乙醇為對照組測的吸光度為A對照組。同時配制相同濃度的谷胱甘肽溶液，相同操作下測定GSH清除DPPH自由基的效果。DPPH自由基的清除能力計算：

(2)

諾鄧火腿抗氧化肽螯合Fe2+能力的測定：根據LEE等[7]的方法，將諾鄧火腿抗氧化肽配成質量濃度為1.0 mg/mL的溶液。分別取1 mL樣品溶液于試管中，加入0.05 mL FeCl2(2 mmol/L)，混勻后加入0.2 mL菲啰嗪 (5 mmol/L)試劑啟動反應，將混合物劇烈搖動混勻后，室溫下靜置10 min，在562 nm波長處測定溶液的吸光度。相同操作條件下，對照管以去離子水代替樣品測得吸光度記A對照組。同時配制相同濃度的谷胱甘肽溶液，相同操作下測定GSH螯合Fe2+的效果。Fe2+螯合率計算方法：

(3)

1.3.3 通過SephadexG-25分離純化諾鄧火腿抗氧化肽

分離純化條件：選擇26 mm×1 m層析柱，諾鄧火腿粗肽配制成20 mg/mL溶液，過濾，上樣量5 mL，蒸餾水經過45 nm過濾后作洗脫液進行洗脫，調節流速0.5 mL/min，每管收集5 mL洗脫液，保持4 ℃環境下。各管在220 nm處測定吸光值，以洗脫體積為橫坐標，吸光值為縱坐標作圖。分別收集各峰處的洗脫液，既得諾鄧火腿抗氧化肽的各組分，記A、B、C、D，冷凍干燥，置-80 ℃保存。

1.3.4 諾鄧火腿抗氧化肽各組分抗氧化活性研究

方法同1.3.2。

1.3.5 通過SephadexG-15分離純化諾鄧火腿抗氧化肽

分離純化條件：選擇26 mm×1 m層析柱，諾鄧火腿抗氧化肽組分C(由1.3.4可知選取組分C進行分離純化)配制成10 mg/mL溶液，過濾，不用進行透析處理，上樣量為1 mL，蒸餾水經過45 nm過濾后作為洗脫液進行洗脫，保持在4 ℃的環境下，調節流速0.25 mL/min，每管收集2.5 mL洗脫液。各管在220 nm處測定吸光值，以洗脫體積為橫坐標，吸光值為縱坐標作圖。分別收集各峰處的洗脫液，既得諾鄧火腿抗氧化肽的各組分，記C1、C2、C3、C4和C5，冷凍干燥，置-80 ℃保存。

1.3.6 諾鄧火腿抗氧化肽各組分抗氧化活性研究

方法同1.3.3。

1.3.7 通過MALDI-TOF- LC-MS諾鄧火腿抗氧化肽的鑒定

使用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀(MALDI-TOF-MS)進行樣品的質譜分析。取1 μL樣品點在干凈的不銹鋼樣品靶上，待室溫干燥后，加入1 μL的基質溶液，待干燥后進行質譜分析。用標準品對質譜儀進行校正，校準至誤差≤10 Da。一級質譜數據采集使用MS-2 KV反射模式，加速電壓設為20 kV，掃描范圍100～10 000 Da、10～60 kDa，激光能量≥3 900，同一樣品同一結晶點，調整采集點，累加至少8個點的數據，保存累加的圖譜，質譜圖累積疊加1 500 次。

樣品經MALDI-TOF-MS采集一級質譜數據后采用納升流速HPLC液相系統Ultimate 3000進行鑒定。緩沖液：A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液。色譜柱以95%的A液平衡。樣品由自動進樣器上樣到質譜預柱C18trap column (C183 μm×0.10 mm×20 mm)，再經分析柱C18column (C181.9 μm×0.15 mm×120 mm) 分離，流速為600 nL/min。

1.3.8 數據分析

試驗重復5次，所有數據均以“平均數±標準差”表示，采用SPSS 19.0軟件進行數據統計與分析，對各組進行單因素方差分析和Duncan′s多重比較，p<0.05做顯著差異檢驗的標準。

質譜分析原始數據為RAW文件，使用軟件Sequest HT和Proteome Discoverer (Thermo)進行查庫鑒定及定量分析。使用數據庫：gi_pig.fasta；查庫時將RAW文件通過Proteome Discoverer提交至Sequest HT服務器，選擇已經建立好的數據庫，然后進行數據庫搜索。

2 試驗結果與分析

2.1 諾鄧火腿抗氧化肽的提取及多肽含量的測定

胰酪蛋白胨標準曲線線性標準方程為Y=0.049 7X+2.078 8(R2=0.994 4)線性好；根據標準曲線換算得諾鄧火腿粗肽中多肽的含量為(72.00±0.99)%。

2.2 諾鄧火腿抗氧化肽抗氧化活性的測定

初步提取的諾鄧火腿抗氧化肽具有一定抗氧化活性，但活性較弱。質量濃度為1 mg/mL的時候、DPPH自由基清除率和·OH清除率分別為14.63%和9.74%，與相同濃度下GSH相比存在極顯著差異，分別降低了61.42%和5.41%。Fe2+螯合率為9.57%，與相同濃度下GSH相比存在極顯著差異，螯合率增加了3.75。

表1 諾鄧火腿抗氧化肽抗氧化活性Table 1 Nuodeng ham antioxidant peptide of antioxidantactivity

注：大寫字母表示同列相比較，相同字母表示無顯著差異(p>0.05)；不同字母表示極顯著差異(p<0.01)。表2、表3同。

2.3 通過SephadexG-25分離純化諾鄧火腿抗氧化肽

圖1為諾鄧火腿抗氧化肽Sephadex G-25柱洗脫圖譜，總洗脫體積為340 mL，諾鄧火腿抗氧化肽經Sephadex G-25色譜分為4個組分(A、B、C和D)，A組分洗脫區間50～125 mL，B組分洗脫區間160～200 mL，C組分洗脫區間200～245 mL，C組分由于有分子量相接近的部分，因此不完全分離，D組分洗脫區間為245～315 mL。

圖1 諾鄧火腿抗氧化肽的Sephadex G-25柱洗脫圖譜Fig.1 The Sephadex G-25 column Nuodeng ham antioxidant peptide elution pattern

2.4 諾鄧火腿抗氧化肽各組分抗氧化活性的測定

由表2可知，分離純化后各組分抗氧化活性差異較大，其中組分C抗氧化活性最強。質量濃度為1 mg/mL時，組分C的DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率和·OH清除率分別達到50.01%、34.37%和48.32%，相同質量濃度下，與其他組分相比，差異極顯著(p<0.01)。

表2 諾鄧火腿抗氧化肽各組分抗氧化活性Table 2 Nuodeng ham antioxidant peptide componentsof antioxidant activity

2.5 通過SephadexG-15分離純化諾鄧火腿抗氧化肽組分C

圖2所示為諾鄧火腿抗氧化肽組分C的Sephadex G-15柱洗脫圖譜，總洗脫體積為450 mL，組分C經Sephadex G-15色譜分為4個組分(C1、C2、C3、C4和C5)。C1組分洗脫區間70～105 mL，C2組分洗脫區間135～160 mL，C3組分洗脫區間185～275 mL，C4組分洗脫區間為245～315 mL，C5組分洗脫區間為360～400 mL，其中C3組分為最高峰。

圖2 諾鄧火腿抗氧化肽組分C的Sephadex G-15柱洗脫圖譜Fig.2 Sephadex G-15 column Nuodeng ham antioxidant peptide fraction C elution profile

2.6 諾鄧火腿抗氧化肽各組分抗氧化活性的測定

由表3可知，組分C分離純化后各組分抗氧化活性差異較大，其中組分C3抗氧化活性最強。當質量濃度為1 mg/mL時，組分C的·OH清除率、DPPH自由基清除率、Fe2+螯合率分別達到73.01%、51.21%、65.23%，相同濃度下，與其他組分相比較差異極顯著(p<0.01)。

表3 諾鄧火腿抗氧化肽各組分抗氧化活性Table 3 Nuodeng ham antioxidant peptide components ofantioxidant activity

2.7 通過MALDI-TOF-MS鑒定諾鄧火腿抗氧化肽C3

使用MALDI-TOF- LC-MS對抗氧化活性最強的組分C3進行肽序鑒定，測得抗氧化肽離子流圖如圖3所示。諾鄧火腿抗氧化肽肽段信息如表4所示，經質譜鑒定諾鄧火腿抗氧化肽8個肽段質譜圖分別如圖3所示，通過對 1號分子離子峰的二級質譜解析，質核比為 881.89，通過與數據庫中蛋白質序列比對可確定 1 號抗氧化肽的序列為 ：QVTSLSGQcHHHDEK，帶2個正電荷，其中C9半胱氨酸甲基修飾；2號分子離子峰二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，確定荷質比為：893.48，帶2個正電荷，其氨基酸序列為：VHQYFNVGLIQPGSVK；3號分子離子峰二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，確定荷質比為：903.96，帶2個正電荷，其氨基酸序列為：QNLLSQSHAHQQFLR；4號離子峰二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，確定荷質比為：912.94，帶兩個正電荷，其氨基酸序列為：GcFKPIVAGDQNVEYK ，其中C2甲基修飾；5號離子峰二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，確定荷質比為：923.46,帶2個正電荷，其氨基酸序列為：AIQISYNPEDLSKPDR；6號離子峰二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，確定荷質比為945.45，帶2個正電荷：其氨基酸序列為：NLHPELGTDADKEHWK；7號離子峰二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，確定荷質比為：768.37，帶3個正電荷，其氨基酸序列為：IRELESQISELQEDLESER；8號離子峰二級質譜結合軟件分析及蛋白質數據庫，確定其荷質比為：671.58，帶4個正電荷，其氨基酸序列為：IHVSDQELQSANASVDDSRLEELK。

3 討論

3.1 火腿中抗氧化肽的提取

提取火腿中抗氧化肽的一般是用鹽酸或磷酸緩沖液，ESCUDERO等[8-9]用0.01 mol/L的HCl溶液從西班牙火腿中提取并分離純化出具有抗高血壓和抗氧化活性的短肽。祝智超等[10]用0.01 mol/L的HCl溶液提取金華火腿中的粗肽， 并用多種體外抗氧化實驗證明金華火腿粗肽具有抗氧化活性。邢陸娟等[11]用0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 7.2)提取宣威火腿中的粗肽，測定粗肽粉中的多肽含量60%。本試驗用磷酸鹽緩沖液提取不同加工時長諾鄧火腿多肽，測得諾鄧火腿粗肽中多肽的含量分別為72.00%；其他使用磷酸鹽緩沖液來提取火腿多肽的研究者的結果相比，多肽含量較高。粗肽粉中可能還含有大分子蛋白質、小分子氨基酸和無機鹽等，因此還可以進一步分離純化，以獲得高純度的多肽。

ABCDEFGH分別表示QVTSLSGQcHHHDEK、VHQYFNVGLIQPGSVK、QNLLSQSHAHQQFLR、GcFKPIVAGDQNVEYK、AIQISYNPEDLSKPDR、NLHPELGTDADKEHWK、IRELESQISEL-QEDLESER、IHVSDQELQSANASVDDSRLEELK 8個肽段的質譜圖圖3 各肽段質譜圖Fig.3 the peptides of mass spectrum

序號氨基酸序列修飾蛋白編號肽段電荷分子質量質荷比檢測方式相對含量1QVTSLSGQcHHHDEKC9(Carbam-idomethyl)I3LQX021 762.78881.89HCD1.0002VHQYFNVGLIQPGSVKI3LTB821 785.95893.48HCD0.9223QNLLSQSHAHQQFLRK9IWG621 806.92903.96HCD0.8884GcFKPIVAGDQNVEYKC2(Carbam-idomethyl)Q9GJV421 824.88912.94HCD0.8345AIQISYNPEDLSKPDRF1RX3521 845.92923.46HCD0.8326NLHPELGTDADKEHWKD2SW9621 889.90945.45HCD0.7277IRELESQISELQEDLESERK9IVP532 303.12768.37HCD0.4178IHVSDQELQSANASVDDSRLEELKK7GRY042 683.30671.58HCD0.325

3.2 火腿抗氧化肽分離純化與鑒定

凝膠過濾色譜是目前最廣泛使用的多肽分離方法之一，基于樣品分子質量達到分離效果，依分子質量從大到小依次洗脫出來，其特點是分離條件溫和，樣品回收率高、操作簡單等[12]。ESCUDERO等[8]研究了西班牙干腌火腿中水溶性的抗高血壓肽和抗氧化肽，在4℃條件下，根據分子質量使用Sephadex G-25凝膠色譜柱，分離肽提取物得到3個組分。實驗結果表明，分離所得的肽具有抗氧化活性，且不同洗脫區間的肽液的抗氧化活性有一定的差異。XING等[13]多次分離純化宣威火腿中的抗氧化肽，使用Sephadex G-25凝膠色譜柱分離得到4個組分，其中第3組分的抗氧化活性最強，然后使用陰離子交換色譜對第3組分進一步分離純化，得到5個組分(C1、C2、C3、C4和C5)，C5組分抗氧化活性高于其他4個組分。本試驗經過Sephadex G-25凝膠色譜和Sephadex G-15凝膠色譜2次分離純化，得到組分C3在質量濃度為1 mg/mL時，·OH清除率、DPPH自由基清除率和螯合Fe2+分別達到73.01%、51.21%和65.23%，與其他組分(C1、C2、C4和C5)相比，差異極顯著(p<0.01)。因此，分子質量小的火腿多肽比分子質量大的活性較高。

抗氧化肽肽肽分離純化后， 用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜法(MALDI-TOF-MS)分析其氨基酸序列[14]，進一步推測分析其抗氧化作用機制。基質輔助激光解吸電離(MALDI)是一種軟電離法，使用特定波長的激光常用的是和紫外激光等照射到樣品靶上，樣品靶上的基質將吸收到的能量傳遞給樣品，使樣品產生瞬間膨脹相變而發生本體解吸，使樣品離子化，從而使基質被激發并輔助質子傳遞。飛行時間質譜法(TOF-MS)在所有的質譜儀中分析速度最快微秒級、質量檢測范圍最寬、離子傳輸率最高[15]。因此MALDI-TOF-MS具有準確率高、分辨率高、靈敏度高、質量測定范圍廣、圖譜直觀等優點，是檢測鑒定微量甚至是痕量蛋白質分子的重要手段。本試驗使用MALDI-TOF-MS分析其氨基酸序列，得到8個肽序。

3.3 抗氧化機理

肽的抗氧化性主要與其分子質量、所含氨基酸種類和氨基酸序列等有關。

3.3.1 多肽分子質量對抗氧化效果的影響

抗氧化肽主要是含有少于20個氨基酸殘基的分子且分子質量小于6 000 Da[16]。LI等[5]的研究表明， 具有強抗氧化活性的肽的分子質量分布在500～1 500 Da之間。火腿的多肽組成可分為5個分子質量范圍， 即4 500～2 700、2 700～1 200、1 200～500、500～375和375～160 Da[17]。金華火腿中的小肽類物質大多由5～16個氨基酸組成，具有一定的疏水性，因此隨著濃度的增加，小肽類物質對自由基的捕獲能力增加，抗氧化性增強[10]。本試驗中抗氧化肽的分子質量分布在881.89～2 683.30 Da，由15～24個氨基酸殘基組成，其中1 762.66 Da含量最高分子質量及氨基酸殘基數較其他研究者稍大，其可能發揮的可能發揮抗氧化作用最大。

3.3.2 多肽所含氨基酸種類對抗氧化效果的影響

氨基酸在抗氧化反應中起著不同的作用， 其主要是作為電子供體， 具有疏水性、能夠直接與自由基結合、形成有利于發揮其抗氧化性及能夠螯合金屬離子等的構象。許多氨基酸本身具有抗氧化性， 如Cys(半胱氨酸)、His(組氨酸)、Trp(色氨酸)、Tyr(絡氨酸)和Ile(異亮氨酸)等。Trp、Tyr和組氨酸能夠作為電子供體， Glu(谷氨酸)能夠與自由基結合起到清除自由基的作用;疏水性氨基酸如Met(蛋氨酸)、Trp、Phe(苯丙氨酸)、Val(纈氨酸)、Leu(亮氨酸)、Ile、Pro(脯氨酸)和Ala(丙氨酸)可以捕獲脂類的自由基， 加強抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸間的相互作用， 從而延緩脂質的氧化反應。酸性氨基酸如Asp(天冬氨酸)和Glu側鏈的羧基可以與金屬離子發生相互作用， 鈍化金屬離子，達到抗氧化效果[18-19]。CHEN等[18]發現， 抗氧化肽的金屬離子親和力與His含量呈正相關。本試驗中測得多肽的氨基酸組成中含大量的Glu、His、Ile、Pro等。

3.3.3 多肽氨基酸序列對抗氧化效果的影響

N-端含有疏水性氨基酸的肽具有更高的抗氧化性，因為疏水性氨基酸可以捕獲脂類自由基和加強抗氧化肽與疏水性多不飽和脂肪酸相互作用，從而延緩脂質氧化反應[19-21]。本試驗中有6個多肽序列是疏水性氨基酸為N-端，相對含量最高的多肽(QVTSLSGQcHHHDEK)也是是疏水性氨基酸為N-端。酸性氨基酸(Asp和Glu)側鏈的羧基可以與金屬離子相互作用，鈍化金屬離子，達到抗氧化效果[20]。本實驗中的8個多肽序列有4個多肽C-端是Asp，因此，Asp位于C-端可能是有利于發揮抗氧化活性的構象。本試驗中測得的肽序含有多個電荷，有研究表明正電荷肽可能在抑制LDL(低密度脂蛋白)氧化上發揮重要的作用[21]。

4 結論

磷酸提取法提取的諾鄧火腿抗氧化肽具有抗氧化活性，抗氧化肽經過Sephadex G-25凝膠色譜分離純化后得到4個組分(A、B、C和D)，通過體外抗氧化試驗(·OH清除活性、DPPH自由基清除活性、螯合Fe2+能力)得出組分C抗氧化活性最強；組分C通過Sephadex G-15凝膠色譜分離純化后得到5個組分(C1、C2、C3、C4和C5)。通過體外抗氧化試驗得出C3體外抗氧化活性最強，C3組分抗氧化活性最強，質量濃度為1 mg/mL時，·OH清除率、DPPH自由基清除率和螯合Fe2+分別達到73.01%、51.21%和65.23%，與其他組分(C1、C2、C4和C5)相比，差異極顯著(p<0.01)，進一步通過MALDI-TOF-MS鑒定C3組分，得抗氧化肽序為：QVTSLSGQcHHHDEK、VHQYFNVGLIQPGSVK、QNLLSQSHAHQQFLR、GcFKPIVAGDQNVEYK、AIQISYNPEDLSKPDR、NLHPELGTDADKEHWK、IRELESQISELQEDLESER、IHVSDQEL-QSANASVDDSRLEELK。