牛乳粉中乳蛋白糖基化分析及其水解程度研究

孫靜麗，杜瑤，朱莉莉，牛鵬飛，李林強

(陜西師范大學 食品工程與營養科學學院，陜西 西安, 710119)

糖蛋白是一種致敏因子[1-2]，食用乳粉可能會因消化不良而引起過敏反應[3-4]。近年來食品資源中糖蛋白的來源及其致敏性一直是研究熱點。1908年美國生物化學家協會的蛋白質命名協會將糖蛋白定義為：由蛋白質分子和包含有碳水化合物基團的物質共同組成的但又不是核酸的一類復合物[5]。糖蛋白具有增強免疫調節、抑制腫瘤、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等十分重要的生理作用[6]，在新型特種藥物及功能性食品開發方面具有廣闊的運用前景，但糖蛋白也可能會引起致敏作用[7-8]。對部分人群而言，飲用牛乳會引起過敏反應，乳中的主要過敏原為：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白[9-10]、牛血清蛋白[11]和 γ-球蛋白[12]，這些蛋白引起過敏反應是蛋白本身結構引起的過敏，還是由于加熱過程中蛋白質發生糖基化后引起的過敏，相關的報道較少[13]。

牛乳中主要含有酪蛋白和乳清蛋白，同時含有豐富的乳糖，牛乳在熱處理的過程中極易發生羰氨反應，產生糖基化蛋白，這些糖基化蛋白是否會影響乳蛋白的水解，進一步引起過敏反應，鮮有相關的研究報道。

本文主要研究分析牛乳粉中酪蛋白和乳清蛋白的糖基化程度及其水解特性，以分析牛乳粉中糖蛋白的來源及其水解特性，完善乳粉營養功能評價理論體系，并為乳粉生產過程中營養品質控制提供理論依據和技術參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂牛乳粉,新西蘭恒天然公司;蛋白Mark(18～90 ku，26～120 ku)，美國Thermo公司;木瓜蛋白酶(≥3 500 U/mg)，美國Bioreagent公司;雙歧桿菌,北京川秀科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷(Tris)、N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED)、十二烷基硫酸鈉(SDS)、考馬斯亮藍G-250、高碘酸、堿性品紅、α-萘酚、茚三酮，均為分析純。

1.2 儀器與設備

800B臺式離心機，上海安亭科學儀器廠；PowerPac TM Universal電泳系統，美國Bio-rad公司；KQ-250DB數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；HY-2往復振蕩器，金壇市富華儀器有限公司；722可見分光光度計，上海光譜儀器有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 酪蛋白的提取

乳粉經索氏抽提法脫脂后，與水以1∶7(g∶mL)的比例配制為復原乳。依次取復原乳5 mL，分別加入10 mL的pH 4.6的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液(鹽析法)、pH 4.6的乙酸溶液(酸提法)、1 g/L鞣酸溶液(生物堿沉淀法)、無水乙醇(有機溶劑沉淀法)、50 g/L乙酸鋅溶液(重金屬離子法)[14-17]，待蛋白沉淀后用濾紙過濾，將過濾所得沉淀放置40 ℃烘箱中烘干至其質量不再發生變化后進行稱重，按下式計算酪蛋白的質量百分數。

(1)

式中：W，酪蛋白質量分數，%；m1，沉淀的酪蛋白質量，g；m，每次所取的復原乳樣液質量，g。

1.3.2 乳清蛋白的提取

1.3.2.1 酸提法和重金屬離子法

依次取復原乳5 mL，分別加入10 mL pH 4.6乳酸溶液、50 g/L乙酸鋅溶液，振蕩混勻，待蛋白沉淀后過濾，取濾液于40 ℃烘箱中烘干濃縮使水分揮發，濃縮比為1∶10，將所得的濃縮后的濾液置于4 ℃冰箱中保存，所得即分別為酸提法、重金屬離子法提取的乳清蛋白。

1.3.2.2 有機溶劑沉淀法

取5 mL的復原乳于離心管中，分別加無水乙醇至體積分數達20%，攪拌，靜置30 min后過濾，所得濾液加無水乙醇，使無水乙醇體積分數達35%，繼續添加無水乙醇直至乙醇體積分數逐漸達到55%，攪拌，靜置30 min，200×g離心5 min，傾去上清液，取沉淀置于4 ℃冰箱中保存。

1.3.2.3 乳酸發酵法

取40 g乳粉索氏抽提脫脂，與水以1∶7(g∶mL)的比例配制為復原乳，加熱至95 ℃，保持15 min，冷卻至42 ℃，添加雙歧桿菌1 g，42 ℃培養6 h，小心吸取上層黃綠色清液，離心沉淀，取清液于40 ℃濃縮至其體積的1/10，濃縮液置4 ℃冰箱中保存。

1.3.3 乳蛋白的SDS-PAGE分析

SDS-PAGE凝膠電泳參考文獻[18-20]，稍作修改。電泳樣品制備：取制備的酪蛋白沉淀物用蒸餾水洗滌3次，200×g離心5 min，取沉淀于40 ℃烘干至恒重，研磨成粉末，取酪蛋白2 mg溶于1 mL樣品緩沖液中，沸水浴處理10 min，冷卻至室溫，即為酪蛋白電泳樣品；取制備的乳清蛋白2 mg溶于1 mL樣品緩沖液中，即為乳清蛋白電泳樣品。SDS-PAGE凝膠電泳：向凝膠板間灌注7 mL 15%的分離膠，立即覆一層蒸餾水，凝固40 min后將上層蒸餾水傾去用濾紙吸干，灌注3 mL 3%濃縮膠，插入樣品梳子，凝固40 min后，將電極緩沖液倒入電泳槽，直至沒過短板，拔梳子，加樣12 μL，開始電泳。80 V恒壓至蛋白染液進入分離膠，120 V恒壓至蛋白染液停在分離膠底部，停止電泳。考馬氏亮藍G-250染液振蕩染色2 h，蒸餾水沖洗，然后加入脫色液至背景透亮、條帶清晰為止。

1.3.4 蛋白的糖基化鑒定

1.3.4.1 高碘酸-希夫堿染色

取制備的酪蛋白、乳清蛋白電泳樣品左右對稱加樣進行SDS-PAGE電泳，將膠從中間均勻地切成兩部分，左邊考馬氏藍染色，右邊對稱樣液進行高碘酸-希夫堿染色[21](簡稱糖染)。

高碘酸-希夫堿染色步驟：將凝膠置于10%三氯乙酸固定1 h，蒸餾水漂洗2次(共0.5 h)，然后置于1%高碘酸水溶液氧化1 h，用水漂洗2次(共0.5 h)，再用Schiff試劑染色1 h(Schiff試劑配制：堿性品紅1 g溶于蒸餾水400 mL，加12 mol/L HCl 4.2 mL，加偏重亞硫酸鈉3.2 g，4 ℃攪勻12 h，加活性炭2 g，振蕩1 min過濾)，最后用脫色液(0.5%的偏重亞硫酸鈉及7%乙酸水溶液按體積比1∶1混合)脫色，4 ℃，若是糖蛋白則呈紅色譜帶。

1.3.4.2 莫氏試驗

參考文獻[22]，修改如下：取3只試管編號，分別加入1 mL的10 g/L葡萄糖溶液、10 g/L酪蛋白溶液(溶于1 g/L的NaCl溶液中)、乳清蛋白，然后加入莫氏試劑(50 g/L的α-萘酚溶液，溶于體積分數95%的乙醇，現配現用)2滴，搖勻。將試管傾斜，沿管壁慢慢加入濃硫酸1.5 mL。硫酸層沉淀于試管底部與糖溶液分成兩層，觀察液面交界處有無紫紅色環出現。

1.3.5 蛋白水解及氨基酸含量測定

1.3.5.1 蛋白水解

發酵法分別制取牛乳和乳粉的酪蛋白和乳清蛋白，并冷凍干燥成粉末，將蛋白分別配置為1 g/L的蛋白溶液(蛋白溶液溶于1 g/L的NaCl溶液中)，各取10 mL，均加1 mL的1 g/L木瓜蛋白酶液，37 ℃恒溫水浴酶解6 h。

1.3.5.2 氨基酸含量測定

采用茚三酮比色法[23-24]。取標準系列溶液(0.0、1.0、2.0、5.0、10、15、20 μg/mL)各1 mL于7支試管中，均加入2 mL pH 5.5的乙酸-乙酸鈉緩沖液，搖勻，再加2 mL 2%茚三酮溶液(2 g溶于100 mL無水乙醇中，現配現用)。沸水浴15 min，冷卻至室溫后，于570 nm波長處測定吸光值，得回歸方程(y=0.031 9x+0.002 5，R2=0.999 5)。將酶解后的樣品用上述同種方法測定蛋白溶液的吸光值，計算其氨基酸含量。

1.4 數據處理

2 結果與分析

2.1 酪蛋白提取方法的篩選

由圖1可知，鞣酸提取的酪蛋白質量百分數為(46.13±0.36)%顯著高于其他組(p<0.05)，乙酸提取的酪蛋白質量百分數顯著高于乙酸鋅、乙醇、乙酸-乙酸鈉組(p<0.05)，乙醇及乙酸-乙酸鈉組對酪蛋白的提取質量百分數無顯著性差異(p>0.05)。綜上結果表明，鞣酸生物堿法是提取酪蛋白的一種較為理想的方法。文獻[25-26]也有類似的報道。鞣酸是一種活性物質，具有抗氧化、抗衰老，預防心血管疾病等作用，具有凝乳的作用，因此鞣酸在乳蛋白的提取中有較大的應用前景。其他方法多為等電點提取法，其中，乙酸沉淀較好于其他幾組，這與文獻[27-28]乙酸沉淀效果好結果相似，但相對于生物堿沉淀法，提取效果顯著低于鞣酸生物堿沉淀法(p<0.05)，這可能是由于等電點法具有一定的可逆性。

圖1 不同方法對酪蛋白提取率的影響Fig.1 Influence of different methods on protein extraction rate注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

2.2 酪蛋白的SDS-PAGE電泳結果

由圖2可知，不同方法提取的酪蛋白均有3條帶，依據標準蛋白Mark條帶比對，其分子質量分別約為24、34和60 ku，這與文獻[29-30]對酪蛋白分子質量的研究結果一致。且不同方法提取的酪蛋白條帶之間位置基本相同，表明不同方法處理對復原乳酪蛋白分子大小影響不大。

1～5.依次為乙酸-乙酸鈉、無水乙醇、鞣酸、乙酸、乙酸鋅提取的酪蛋白圖2 不同方法提取的乳粉酪蛋白SDS-PAGE分析Fig.2 Analysis of SDS-PAGE on casein from milk powder treated by different extraction methods

2.3 乳清蛋白的SDS-PAGE電泳結果

不同方法(乳酸、乙酸鋅、乙醇、發酵)提取的乳清蛋白的SDS-PAGE的結果(見圖3)顯示，僅有乳酸發酵法提取的乳清蛋白具有明晰的電泳條帶，其分子質量分別約為14和18 ku，分別是α-乳白蛋白和β-乳球蛋白，這與文獻[31]關于乳清蛋白分子質量的結果一致。

1～4. 依次為乳酸、乙酸鋅、乙醇、發酵提取的乳清蛋白圖3 不同方法提取的乳粉乳清蛋白SDS-PAGE分析Fig.3 Analysis of SDS-PAGE on whey protein from milk powder treated by different extraction methods

綜上表明，酸提法、重金屬離子法、乙醇沉淀法提取乳清蛋白效果不理想。酸提法可能使酪蛋白迅速達到了等電點、重金屬離子法迅速使蛋白變形沉淀、乙醇沉淀法迅速破壞蛋白質外的水膜，以上沉淀法迅速形成網狀進行聚沉，酪蛋白包埋了大部分的乳清蛋白，乳清蛋白無法析出[32]。文獻[33-34]中采用了酸提法和乙醇沉淀法提取乳清蛋白，這與本文的結果有出入，具體原因還需進一步研究。而乳酸發酵法是一個蛋白緩慢凝聚，乳清逐漸釋放的過程，這也印證了生產奶酪是生產乳清的一種常用的工業方法。

2.4 酪蛋白高碘酸-希夫堿染色結果

酪蛋白SDS-PAGE考馬氏亮藍染色和高碘酸-希夫堿染色結果見圖4。考馬氏亮藍染色有3條帶(圖4-a)，其分子質量分別約為24、34和60 ku。高碘酸-希夫堿染色有2條帶(圖4 b)，其分子質量分別為24和34 ku，為糖基化酪蛋白。分子質量60 ku的酪蛋白不是糖基化蛋白，這與文獻[35-36]中分子質量60 ku的蛋白在糖染結果中不出現條帶的結果一致。

1～3-依次為乙酸、乙酸鋅、乙醇提取的酪蛋白；a-考馬氏亮藍G-250染色;b-高碘酸—希夫堿染色圖4 乳粉酪蛋白的不同染色方法SDS-PAGE分析Fig.4 Analysis of SDS-PAGE on casein from milk powder treated by different dyeing methods

2.5 乳清蛋白高碘酸-希夫堿染色結果

由圖5可見，泳道1、2在考馬氏亮藍G-250染色的條帶中，共有2條帶，經過與標準蛋白Mark比對，其分子質量約為14和18 ku。在高碘酸-希夫堿條帶中則只有分子質量為14 ku的蛋白，則可說明在牛乳粉乳清蛋白中分子質量14 ku的蛋白是糖基化蛋白，分子質量18 ku的蛋白不是糖基化蛋白。

a-考馬氏考馬氏亮藍G-250染色(藍色);b-高碘酸—希夫堿染色(紅色);1～2-均為發酵法提取的乳清蛋白圖5 乳粉乳清蛋白的不同染色方法SDS-PAGE分析Fig.5 Analysis of SDS-PAGE on whey protein from milk powder treated by different dyeing methods

2.6 蛋白的莫氏試驗鑒定結果

葡萄糖標準溶液莫氏試驗有很明顯的紫色環(圖6-a)，酪蛋白莫氏試驗中，糖液與硫酸交界處呈淡淡的紫環(圖6-b)；乳清蛋白莫氏試驗也呈現明顯的紫色環(圖6-c)。結果表明，酪蛋白及乳清蛋白中都含有糖蛋白，這與上文中電泳的糖染的結果保持一致，進一步證實牛乳粉中存在糖基化的酪蛋白與乳清蛋白。

a-葡萄糖標準溶液;b-酪蛋白;c-乳清蛋白圖6 乳清蛋白和酪蛋白莫氏試驗顏色比較Fig.6 Comparison on color of whey protein and casein treated by morse experiment

2.7 乳蛋白水解程度比較

由圖7可見，乳粉酪蛋白和乳清蛋白木瓜蛋白酶水解后游離氨基酸含量均顯著低于鮮乳酪蛋白和乳清蛋白(p<0.05)，說明牛乳經過一系列單元熱處理后乳蛋白水解程度降低。

圖7 乳粉與鮮乳中乳蛋白水解程度比較Fig.7 Comparison of degree of hydrolysis by papain between milk powder and fresh milk注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。

本文酪蛋白SDS-PAGE分析結果表明，其主要有分子質量約為24、34和60 ku的3種蛋白，其中，前2種均為糖基化蛋白，文獻[37]報道，它們分別占牛乳總蛋白的40.8%和28%，是酪蛋白的主要組成部分，文獻[38]中報道糖基化改變蛋白的化學穩定性和熱穩定性，進而可能影響蛋白的水解，這與本文的結果相近，顯然糖基化的酪蛋白是影響酪蛋白水解程度的主要因素之一。

本研究結果表明，乳清蛋白主要含有分子質量為14 和18 ku的2種蛋白，其中14 ku的乳清蛋白為糖基化蛋白，其在牛乳總蛋白含量為3.7%[32]。文獻[39-40]報道α-乳白蛋白為牛乳中主要過敏原之一，顯然其水解程度是導致其致敏性的主要原因。綜上所述，乳蛋白糖基化對其水解程度有一定影響，文獻[37]稱，加熱導致牛乳蛋白的二、三級結構受到破壞，導致牛乳不好溶解，并未與蛋白的水解程度有直接關系。因此水解程度可能是由于蛋白糖基化引起的，但是這些糖基化乳蛋白是乳在加熱過程產生的還是牛乳本身固有的，還有待進一步研究。另外，若針對乳粉產品中具有致敏性的糖蛋白加入其專一性的水解酶，可能是降低或消除某些糖蛋白致敏性的一條有效途徑。

3 結論

本文分析了牛乳粉中酪蛋白和乳清蛋白的糖基化及其水解特性，結果表明牛乳粉中分子質量為24和34 ku的酪蛋白和分子質量14 ku的乳清蛋白為糖基化蛋白。蛋白酶水解試驗結果表明，牛乳粉中酪蛋白和乳清蛋白水解程度均顯著低于鮮乳，這是由于加熱后蛋白空間結構的變化所致還是由于蛋白糖基化引起的，有待進一步研究。