代謝組學在冠心病痰瘀互結證診斷中的研究進展*

蔡雪朦，王 朔，高 杉，李 琳，李遇伯，于春泉

（天津中醫藥大學，天津 300193）

《中國心血管病報告2016》的數據顯示，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病110萬例，占心血管患病人數的第二位。在中國患者過早死亡的原因中，冠心病從1990年的第七位上升至2013年的第三位[1-2]。中醫學無冠心病病名，從臨床表現看屬于“胸痹”、“真心痛”范疇。近年來冠心病診斷的“金標準”仍然是冠狀動脈造影術，但因其伴隨的一些副作用限制了大規模的人群篩查和早期風險預測。且中醫治療冠心病是以癥狀、體征、舌脈等一系列證候要素為依據，缺乏客觀量化的標準。冠心病中醫證候臨床流調顯示，與痰、瘀相關的證候最為多見，痰瘀互結證已成為冠心病的常見證候[3]。代謝組學方法可以實現疾病與證候的精準診斷，它強調把人作為一個整體來研究，同時在方法學上具有無創傷、動態、接近生理條件等特點，與中醫治病整體性和動態性不謀而合。代謝組學已成為一種成功的研究技術廣泛應用于眾多醫學相關領域，如疾病診斷、藥效作用機制、藥物毒理學等。筆者對其近年來在冠心病早期診斷和痰瘀互結證研究方面取得的進展進行綜述，籍以為冠心病痰瘀互結證的診斷提供客觀指標，為臨床治療冠心病痰瘀互結證提供療效評價依據。

1 代謝組學在冠心病診斷中的研究

冠心病診斷的生物標志物范圍廣，涉及磷脂代謝、能量代謝、脂肪酸分解、腸道微生物代謝物等。

1.1 磷脂代謝 磷脂代謝是冠心病生物標志物研究的熱點之一，其中溶血磷脂酰膽堿（LysoPC）、溶血磷脂酰乙醇胺（lysoPE）和鞘氨醇可作為冠心病診斷的標志物。LysoPC又稱溶血卵磷脂，被認為是促炎和致動脈粥樣硬化的代謝產物，其水平升高可誘導內皮細胞產生氧化應激，導致心血管疾病[4]；但LysoPC有助于抑制巨噬細胞的合成，阻止巨噬細胞泡沫化，減少膽固醇積累和動脈粥樣硬化[5]，Stegemann C等[6]也發現LysoPC和冠心病之間存在負相關。有文獻報道顯示LysoPC可以根據細胞類型或氧化、炎癥狀態從而發揮促或抗動脈粥樣硬化的作用[7]。Ju YP等[8]研究表明在冠心病心絞痛和心肌梗死患者的血清代謝物中，含有不飽和脂肪酸和游離脂肪酸的LysoPC和lysoPE與冠心病風險增加相關，而含有飽和脂肪酸的lysoPC與冠心病風險降低相關。Gao X等[9]代謝組學分析顯示，與對照組相比，冠脈疾病患者植物鞘氨醇顯著上調。鞘氨醇的積累是由鞘磷脂酶水解鞘脂的作用引起的，鞘脂具有降低甘油三酯和膽固醇水平的能力，然而患者血漿樣品中鞘氨醇的濃度較高，表明鞘脂被耗盡從而增加了冠心病的風險。同樣地，在心肌缺血大鼠模型中鞘氨醇也顯示出增高的趨勢[10]。

1.2 能量代謝 三羧酸循環（TCA循環）和脂肪酸的β氧化是冠心病患者體內的主要能量來源，肉堿類物質和丙酮類物質可作為冠心病診斷的標志物。脂肪酸活化成脂酰CoA，小于10個碳的脂酰CoA容易穿過線粒體內膜進行氧化反應，大于10個碳的脂肪酸分子則需要肉堿的參與，肉堿的功能是將長鏈脂肪酸轉運到線粒體中進行β氧化以獲得大部分能量。Li Y等[11]鑒定出與冠心病關聯性極強的肉毒堿在冠心病組中顯著增加。Laborde CM等[12]對非ST段抬高的ACS患者的血樣和尿樣進行代謝組學分析，發現患者3-羥基丁酸水平較高。3-羥基丁酸與乙酰乙酸鹽、丙酮共同組成酮體，血、尿中酮體水平升高說明脂肪分解代謝產生的ATP作為冠心病患者體內的能量來源，推測其可能是由于缺氧導致的TCA循環受抑導致的，TCA產能降低“促使”這些細胞利用脂肪作為能量來源。這與Kang SM等[13]對HF患者代謝譜的研究結果一致：丙酮，乙酰乙酸的尿排泄增加，TCA循環中間體檸檬酸鹽，琥珀酸鹽等代謝物的尿排泄減少。

1.3 不飽和脂肪酸及其代謝物 不飽和脂肪酸中ω-3多不飽和脂肪酸、ω-6多不飽和脂肪酸、代謝產物EET以及含有不飽和脂肪酸的磷脂過氧化物可作為冠心病診斷的標志物。

多不飽和脂肪酸（PUFA）是一類保健型油脂，包括二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）、亞油酸（LA）、花生四烯酸（AA）等，其中與魚油相關的DHA和EPA屬于ω-3多不飽和脂肪酸（ω-3PUFA），有降膽固醇、減肥及抗動脈硬化等作用。研究發現，EPA等ω-3PUFA可減少白細胞的內皮相互作用，抑制炎癥刺激物的產生，可通過抑制核因子NF-κB活性直接下調炎癥基因，并和PPARs通路的激活有關[14]。除ω-3PUFA外，近年來堅果和油類（例如紅花和玉米油）中ω-6 PUFA保護心血管的潛在機制也引起了研究者的關注。Würtz P等[15]對前瞻性隊列研究中冠心病患者的代謝物進行分析鑒定發現了較高濃度的ω-6 PUFA與較低的冠心病風險相關，且均通過抗炎機制發揮心臟保護作用。Steffen BT等[16]使用氣相色譜和酶聯免疫法分別檢測血漿ω-6 PUFA濃度以及IL-6、TNF-α、sICAM-1等炎癥內皮活化指標，發現ω-6 PUFA有差異性相關：LA和AA與炎癥標志物呈負相關；GLA（γ-亞麻酸）和DGLA（二高-γ-亞麻酸）則與炎癥和內皮活化標記正相關。而Li等[11]發現重度CHD患者的LA水平升高，且LA水平每增加一倍，CHD風險隨之增加6.13倍。

脂肪生成（DNL）是一種內源性途徑，即碳水化合物和蛋白質被轉化為脂肪酸。為了研究DNL產生的特定脂肪酸，包括棕櫚酸、棕櫚油酸，7-十六碳烯酸和順式-異油酸是否影響冠心病，Wu JH等[17]對2890例年齡≥65歲的受試者開展社區前瞻性代謝組學研究，結果顯示異油酸和7-十六碳烯酸的循環濃度與冠心病風險增加有關，相比之下，棕櫚酸和棕櫚油酸與冠心病無明顯相關。棕櫚酸作為最豐富的飽和脂肪酸（SFA），Li等發現了其攝入量與CHD發展之間存在很強的正相關關系[11]。

AA可被細胞色素CYP2J2酶代謝生成四種環氧二十碳三烯酸（EET）的同源異構體，EET是一種內生性脂質環氧化合物，對心血管有多種保護作用。Oni-Orisan A等[18]的研究表明，阻塞性CAD的存在與較低的循環EET水平相關。EET作為不飽和脂肪酸的代謝產物，強大的抗炎特性可通過抑制NF-κB和IκB激酶的活性阻止白細胞黏附至血管壁，這一作用獨立于它的擴血管作用；含有PUFA的磷脂是自由基誘導的脂質過氧化（LPO）的主要靶標，AA和LA被酯化為LDL中的磷脂和膽固醇，隨后的氧化產物氧化磷脂（oxPLs）在動脈粥樣硬化進程中起著重要的作用，含有PUFA的氧化磷脂成為冠心病的新型生物標志物。Lu J等[19]研究發現含有PUFA的磷脂過氧化物可明顯區分冠心病患者和健康人的血漿代謝譜。

1.4 腸道微生物代謝物 近年來，飲食的“代謝過濾器”—腸道微生物成為冠心病研究的熱點，它不僅可以作為CHD診斷的潛在標志物，還可以通過調整患者的腸道生態系統來開發新的治療策略。TMAO已成為動脈粥樣硬化疾病的公認標志物。Qiang F[20]等對冠心病患者的血、尿進行代謝組學研究，發現LysoPC和甘油磷酸膽堿可被腸道微生物酶復合物分解形成氣體TMA，隨后被肝臟黃素單加氧酶（FMO）有效地吸收代謝形成TMAO，從而促進動脈粥樣硬化的發生。Wang Z[21]等開展動物實驗證明膳食磷脂酰膽堿和其他含TMA的物質（如甜菜堿）可增強小鼠動脈粥樣硬化病變的發展。此外，Qiang F多次在CHD患者的血漿和尿液中鑒定出甘露醇，Spearman相關分析顯示，梭菌屬物種HGF2，鏈球菌屬物種M334和鏈球菌屬M143在甘露醇代謝中發揮重要作用，甘露醇已被鑒定為CHD的新型生物標志物。

2 代謝組學在冠心病痰瘀互結證中的研究

據冠心病患者中醫證候學特征統計，在34640例冠心病患者中，排在前2位的為：心血瘀阻5 202例，占 15．02%；痰阻心脈 4 671 例，占 13．48%[3]，代謝組學對其中醫證型的研究也多集中在這兩大證型。

2.1代謝組學在冠心病血瘀證中的研究 活血化瘀法是中醫學的重要組成部分，陳可冀院士繼承“瘀滯內結之血為血瘀”等理論，賦予冠心病血瘀證內涵，代謝組學的發展則為血瘀證客觀化診斷提供了新的分子靶標。史琦等[22]對不穩定心絞痛血瘀證患者的尿液進行代謝組學研究，發現檸檬酸、脯氨酸、異亮氨酸等（具體見表1）可能是血瘀證的特異標志物，主要涉及糖類、氨基酸以及能量代謝紊亂，并存在肝腎損害。血樣結果認為含量均升高的肉堿、膽堿、丙酮等是心血瘀阻證患者的代謝產物，存在脂代謝加強、氨基酸代謝紊亂及腎功能損傷[23]。簡維雄等[24]檢測冠心病患者心血瘀阻證、非心血瘀阻證及對照組的血漿代謝物，得到花生四烯酸、硬脂酸、乳酸等為冠心病心血瘀阻證的血漿代謝標志物，與葡萄糖代謝、脂肪酸代謝紊亂密切相關。同理，對以上受試者的尿液進行全面檢測得出結論：葡萄糖、甘油等為冠心病心血瘀阻證的尿液代謝標志物[25]，主要存在脂肪酸分解加快、糖代謝異常和肝腎功能的損壞。鄭景輝、陳夏等采用KEGG分析信號通路、HMDB檢索相關的酶或轉運蛋白聯合metPA網絡軟件將代謝產物路徑可視化，得出糖酵解和糖異生、脂肪酸合成通路參與冠心病心血瘀阻證的形成[26]；尿液代謝組結果則主要涉及半乳糖代謝、酮體的合成和降解通路[27]。王勇等[28-30]通過放置Ameriod環制備慢性心肌缺血血瘀證和氣虛血瘀證小型豬模型，對兩種證型的小型豬血清內源代謝物進行分析，結果發現檸檬酸、肌酸、γ－氨基丁酸等可作為血瘀證的生物標志物，而氣虛血瘀證則涉及檸檬酸、硬脂酸、甘油等代謝物。魏星等[31]分析冠心病血瘀證組和非血瘀證組及健康人的血液代謝物，結果顯示健康對照組與冠心病患者、血瘀證組和非血瘀證組的血漿代謝物有明顯分離趨勢，其中膽固醇和木糖醇有望作為冠心病血瘀證的生物標志物。華何與等人[32]對冠心病心絞痛心血瘀阻、氣滯血瘀、氣虛血瘀三種血瘀證患者的血漿進行代謝組學分析，1HNMR代謝譜差異能在一定程度上區分氣虛血瘀證與其他血瘀證，檸檬酸、3-羥基丁酸、丙酮等代謝物含量降低，可作為氣虛血瘀證的生物標志物。黃亞麗[33]總結了冠心病血瘀證與健康人樣本的可能差異代謝物共40個，代謝物主要集中在氨基酸、脂肪酸，涉及代謝通路主要包括能量代謝、氨基酸代謝、核苷酸代謝和脂質代謝。

2.2 代謝組學在冠心病痰濁證中的研究 2017年8月，中國中醫科學院病證研究中心的胡鏡清研究員在首屆中醫痰瘀互結證基礎與臨床學術研討會上發布了《冠狀動脈粥樣硬化性心臟病痰濕證臨床診斷標準》[34]。除了血脂、CRP、Hcy等指標，筆者試圖尋找新型生物標志物作為冠心病痰濁證診斷的依據。張紅栓等[35]對冠心病痰濁證、血瘀證患者的血漿進行研究，結果顯示低密度和極低密度脂蛋白、酮體、葡萄糖等含量均高于血瘀證組，表明痰濁證存在更嚴重的脂代謝和糖代謝紊亂，這與杜武勛等的研究結果相一致[36]。尿樣代謝組學結果顯示[37]，α-酮戊二酸、順式-烏頭酸、檸檬酸等為冠心病痰濁證的生物標志物，表明冠心病痰濁證與TCA循環、脂肪酸代謝等密切相關。陳浩等[38]檢測健康組、氣虛血瘀證組和氣虛血瘀痰濁證組的血、尿內源性代謝物，結果顯示馬尿酸、氨基葡萄糖、果糖胺、甘油三酯這四種物質有可能成為痰濁證的生物標志物。鹿小燕等[39]比較痰濁證和血瘀證患者的血清代謝組學，結果發現兩組差異代謝物主要有蘋果酸、葡萄糖、甘氨酸以及不飽和脂肪酸等，其中ω-3PUFA系在痰濁組中降低，表明痰濁組具有更高的血脂水平和血液黏稠度。程鵬等[40]測定痰凝心脈證、心氣虛弱證的冠心病患者血清內源性代謝物，分析顯示痰濁證絲氨酸、纈氨酸、2-羥基丙酸等顯著高于氣虛證組。Zhao L等[41]基于UPLC-Q-TOF/MS和多變量統計分析將健康者與冠心病痰證和瘀證患者的基礎代謝物主要區別開來，主要涉及花生四烯酸代謝，氨基酸代謝和能量代謝等，其中17，20-二甲基前列腺素F1α、PGH 2-EA等可能成為痰濁證的生物標志物。

綜上所述，冠心病血瘀證主要涉及葡萄糖代謝、脂肪酸代謝、TCA、氨基酸代謝、能量代謝、酮體的合成和降解以及肝腎功能的損害；痰濁證則存在更嚴重的脂代謝和糖代謝紊亂。盡管現如今對冠心病痰瘀互結證的代謝組學研究尚不完善，但從病因學的角度不難推測冠心病痰瘀互結證的代謝組學與糖脂代謝、能量代謝等相關。

表1 冠心病痰、瘀證的主要代謝標志物研究

3 展望

代謝組學技術已成功應用于冠心病研究領域，為冠心病的臨床診斷提供新的方法。但代謝組學研究的對象是體內代謝物，這就容易受性別、年齡、飲食等環境因素的干擾，這些變化都會對結果的分析帶來困難。需要注意的是待測樣品的穩定性、取樣至冷凍之間的時間里也可能會改變待測樣品的代謝物譜。因此，擴大臨床試驗的樣本量及匹配分析,必要時進行隨機雙盲對照重復試驗、驗證結果。