黑花生原花青素優化提取條件的研究

劉貴忠

（1.德州學院 物理與電子信息學院；2.山東省功能大分子生物物理重點實驗室，山東 德州 253023）

原花青素由兒茶素、表兒茶素、沒食子酸三種單體及其衍生物聚合而成，可形成二聚體、三聚體、四聚體乃至十聚體.通常將二至四聚體稱為低聚體，五聚體以上稱為高聚體[1].原花青素為雙黃酮衍生物的天然多酚、生物類黃酮化合物，廣泛存在于生物組織中，主要功能為抗氧化、清除自由基，是活性很強的天然產物，有抗腹瀉、抗潰瘍、抗疲勞、防癌抗癌、抗突變、防輻射、促進毛發生長等多重療效，可預防自由基引起的心臟病、關節炎等多種疾病，因而在保健食品、化妝品等領域廣泛應用[2-6].由于不同來源的原花青素組分差別很大，螯合劑的結構不同，二者之間的作用方式、作用強度不同，因而提取條件也不同，很難找到一種普遍適用的提取方法[7-17].

為研究黑花生原花青素的提取方法優化，采用有機溶劑法提取黑花生原花青素，在有機溶劑濃度、水浴溫度、水浴時間、料液比四個影響因素下，利用正交試驗方法確定最佳提取條件.

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

紫外分光光度計（BLUE-Star，北京萊博泰科）,旋轉蒸發儀（RE-52AA,上海亞榮）,電子天平（梅特勒），粉碎機(TYSP-200)，恒溫水浴鍋，真空泵，冷凍干燥箱等.兒茶素標準品（合肥博美生物科技有限責任公司），無水乙醇，濃鹽酸，香草醛（上海生工），石油醚（上海生工），均為分析純，黑花生（黑豐，山東省農科院資源中心）.

1.2 方法

采用正交試驗法研究四種提取因素對黑花生原花青素提取的影響.

1.2.1 兒茶素含量標準曲線

溶液配制 稱取兒茶素標準品20mg，用超純水溶解，定容至10mL容量瓶中，作為兒茶素標準品溶液.取2g香草醛溶于50mL甲醇（均為上海生工,分析純），并加入25mL濃鹽酸，配成香草醛-鹽酸溶液.

標準曲線 在10mL容量瓶中分別加入兒茶素標準品溶液 0、0.5、1、1.5、2、2.5mL，用超純水定容，依次移取 1mL加入9mL香草醛-鹽酸溶液，避光反應20min，在500nm處測定吸光值[19-22]，并以兒茶素質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，用origin8.0軟件作標準曲線如圖1.標準曲線擬合方程為

圖1 原花青素標準曲線

1.2.2 黑花生中原花青素的提取

黑花生種子預處理:黑花生種子剝離內衣、烘干，于粉碎機中粉碎，用1:3料液比的石油醚脫脂48h，抽濾，將濾渣烘干備用.

原花青素的提取:稱取一定量的處理過的花生于容器中，在一定的溶劑濃度、料液比、水浴溫度、水浴時間下酸化處理，將所得浸提液抽濾，濾液于干燥箱烘干，加超純水溶解，定容至10mL容量瓶中，得到原花青素粗體液，取1mL原花青素粗提液加入9mL香草醛-鹽酸溶液，避光反應20min，取3mL反應后溶液，用紫外-可見分光光度計測500nm處吸光度，按標準曲線擬合方程（1）計算樣品原花青素含量[20-22].

1.3 工藝優化試驗說明

根據彭芳剛方法[15]，以原花青素提取量為考察標準，以乙醇濃度、料液比、水浴時間和水浴溫度為影響因素，先對各因素進行單因素試驗，在此基礎上對4因素正交試驗，對試驗結果采用SPSS（Statistical Product and Service Solutions）13.0統計軟件進行分析[23-26].

2 結果與分析

2.1 單因素提取影響試驗

2.1.1 提取溶劑濃度對黑花生中原花青素提取效果的影響

研究表明，原花青素在水中的溶解度要大于在有機溶劑中的，但是水作提取劑會溶入其他如多糖、蛋白質等成分，增加分離的難度，所以一般用有機溶劑作為提取劑.常用的有機溶劑提取劑有甲醇、丙酮和乙醇，由于前兩種有環境危害，所以選擇乙醇作為提取溶劑.

取重量各為1g的處理后的黑花生粉末，按料液比1:18分別加入濃度為20%，35%，50%，65%，80%，95%的乙醇溶液中，放入70℃的恒溫水浴鍋中水浴30min,抽濾，濃縮，干燥，得到原花青素粗提物，超純水（或雙蒸水）溶解，測吸光度，原花青素含量計算方法按照1.2.2中的操作，重復3次取平均值，由公式（1）計算原花青素的含量，結果如圖2所示.

圖2 乙醇濃度對提取效果的影響

由圖2可知，黑花生原花青素的提取量與乙醇濃度之間并沒有明顯線性關系，其中在濃度35%和80%處原花青素的提取量比較大，而且乙醇濃度35%的原花青素提取量大于乙醇濃度80%的原花青素提取量，大約高出40.2%.由圖可知，乙醇濃度65%時提取量最低，且圖像走勢大約以乙醇濃度65%為對稱軸，大體上呈兩側對稱趨勢，表明在乙醇和水比例接近1:1時，原花青素的溶解度較小，這可能與其多羥基的分子結構有關，含醇羥基的有機溶劑對多酚具有良好的溶解性，含水的有機溶劑對多酚的溶解能力比純有機溶劑大，水可破壞多酚分子間的氫鍵從而減弱多酚間的締合，有利于多酚的溶出.因此確定乙醇濃度35%為最佳提取劑濃度.

2.1.2 料液比對黑花生中原花青素提取效果的影響

取質量為1g的處理后的花生粉末，分別按料液比1:6，1:8，1:10，1:12，1:14，1:16，1:18，1:20 （g/mL） 加入濃度為30%的乙醇溶液中，于60℃的恒溫水浴鍋中水浴40min，抽濾，濃縮，干燥，得到原花青素粗提物，超純水（或雙蒸水）溶解，測吸光度，按照1.2.2中的操作，由公式（1）計算原花青素的含量，重復3次取平均值，結果如圖3所示.

圖3 料液比對提取效果的影響

由圖3可知，隨著料液比的增加，提取的黑花生原花青素含量呈先上升后緩慢下降的趨勢.在料液比為1:18時含量最高，之后隨著料液比增加提取的原花青素含量下降，如果再繼續增加不僅不能提高提取率，還會增加提取成本.因此，最佳料液比為1:18.

2.1.3 水浴時間對黑花生中原花青素提取效果的影響

取重量各為1g的處理后的花生粉末，分別按料液比1:18加入濃度為35%的乙醇溶液中，放入60℃的恒溫水浴鍋分別水浴 20，30，40，50，60min,抽濾，濃縮，干燥，溶解，測吸光度，按照1.2.2中的操作，原花青素含量由公式（1）計算，重復3次取平均值，結果如圖4所示.

圖4 水浴時間對提取效果的影響

從圖4可知，在40min時，黑花生原花青素的提取量出現峰值，兩側呈下降趨勢.原花青素結構比較穩定，在水浴時間比較短時不能有效的進入有機溶劑.水浴時間過長，溶液中的膠質體濃度也快速增大，分離變得很困難，因此，水浴時間以40min為宜.

2.1.4 水浴溫度對黑花生中原花青素提取效果的影響

取質量為1g的處理后的花生粉末，分別按料液比1:18加入濃度為35%的乙醇溶液中，分別放入30，50，70℃的恒溫水浴鍋中水浴40min,抽濾，干燥，溶解，測吸光度，按照1.2.2中的操作，由公式（1）計算原花青素的含量，重復3次取平均值，結果如圖5所示.

圖5 水浴溫度提取效果的影響

從圖5可知，黑花生原花青素的提取含量隨著水浴溫度的增加而增加，70℃時黑花生原花青素提取量最大.試驗中沒有測定溫度超過70℃時的提取情況，因為乙醇的沸點為78.4℃，繼續提高溫度會導致乙醇蒸發，造成試驗結果誤差，所以最佳水浴溫度選為70℃.

2.2 結果與分析

在單因素試驗的基礎上，以原花青素提取量為考察標準，以乙醇濃度、料液比、水浴時間和水浴溫度為影響因素，進行4因素3水平正交試驗，因素水平設計見表1，正交試驗設計及結果見表2.

用SPSS13.0統計分析軟件分析，結果見表3—表6的單因素影響可直觀的得出結果，各因素水平對結果的影響強弱順序是：A1＞A3＞A2，B2＞B1＞B3，C1＞C2＞C3，D2＞D3＞D1.由上統計可知，A、B、C、D四個因素都為處理因素，該設計沒有考慮試驗誤差.從表7可知，Type III Sum of Squares Dmin（平方和）=0.0105,表示水浴時間對試驗結果影響最小，因而可作為誤差估計，以檢測其他因素作用的顯著性[28-30].

表1 正交試驗因素水平

表2 正交試驗設計及結果

表3 單因素乙醇濃度影響分析

表4 單因素料液比影響分析

表5 單因素水浴溫度影響分析

表6 單因素水浴時間影響分析

表7 正交試驗結果分析

3 結論

從表7可知，各因素影響試驗結果重要次序為A＞C＞B＞D,由方差分析可知，乙醇濃度（A）對原花青素提取量有顯著性影響，其sig.=P＜0.05（其中0.05為設定的顯著性水平值），水浴時間（D）對原花青素提取量影響最不顯著，綜合各種因素，確定黑花生原花青素有機溶劑提取法的最佳提取工藝為A1B3C2D2，即：乙醇濃度為35%，料液比為1:18，水域溫度60℃，水浴時間40min，提取液中原花青素含量為0.86469349mg·mL-1.