桑葚中烯酰嗎啉殘留量測定

李國烈

（南充農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測檢驗中心，四川南充 637000）

烯酰嗎啉（dimethomorph），化學名稱為4-[3-(4-氯苯基)-3-(3,4-二甲氧基苯基)丙烯酰]嗎啉，存在2種異構(gòu)體（Z、E型）。其為高效卵菌綱真菌殺菌劑，具有內(nèi)吸、治療和抗孢子形成等特性，對卵菌生命周期的各個階段都有效[1]。烯酰嗎啉影響病原菌細胞壁分子結(jié)構(gòu)的重排，干擾細胞壁聚合體的組裝，進而干擾細胞壁的形成。其可用于防治多種作物上由霜霉屬和疫霉屬病菌引發(fā)的病害，且與甲霜靈、苯霜靈等苯基酰胺類殺菌劑無交互抗性[2-3]。烯酰嗎啉廣泛用于蔬菜和水果，因此，其殘留具有較高的檢出率[4]。報道的烯酰嗎啉殘留檢測分析方法主要有氣相色譜法[5-6]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-8]、液相色譜法[9]和高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10-11]，檢測基質(zhì)包括葡萄[7-8]、草莓[6]、龍眼[12]、柑橘[13]、檸檬[7]、黃瓜[9,14-15]、大蒜[16]、辣椒[13]、煙草[11]、大豆[17]、番茄[18]、甘藍[3]、白菜[19-20]、萵筍[21]、油麥菜[21]、胡椒[5]、大蔥[22]、生姜[18]、胡蘿卜[18]、菠菜[18]、白木耳[18]、洋蔥[7]、三七[23]和人參[24]等。

桑葚（mulberry）含有豐富的糖分、氨基酸、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)以及桑色素、桑素、黃酮類化合物等活性物質(zhì)，具有豐富的營養(yǎng)價值和藥用價值[25]。我國將其列為“既是食品又是藥品”的農(nóng)產(chǎn)品[26]。桑葚病蟲害的防治通常以化學防治為主[27]。在實際生產(chǎn)中，由于用藥不當易造成桑葚中化學農(nóng)藥殘留污染，危害人類健康和產(chǎn)業(yè)發(fā)展。李國烈等[28-30]報道了桑葚中醚菌酯、噻蟲嗪、吡蟲啉和啶蟲脒的殘留檢測。覃明麗等[31]和趙鑫等[32]報道了桑葚中樂果、甲基硫菌靈和腐霉利的殘留分析方法，但尚未見關(guān)于烯酰嗎啉在桑葚中的殘留分析報道。本試驗建立了桑葚中烯酰嗎啉殘留檢測的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法（UPLC-MS/MS），并研究了在該試驗條件下烯酰嗎啉在桑葚中的基質(zhì)效應(yīng)，以期為桑葚中烯酰嗎啉的殘留分析檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 標準品和試劑

烯酰嗎啉標準品購于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護科研監(jiān)測所（標準品編號為SB05-140-2008）；甲醇、乙腈、甲苯、甲酸等試劑均為質(zhì)譜級，購于Fisher公司。

1.2 儀器和設(shè)備

Acquity UPLC/Xevo TQ-S超高效液相色譜-質(zhì)譜儀、Xbridge C18色譜柱（50 mm×3.0 mm，3.5 μm），Waters公司；FP3010勻漿機，德國Braun公司；ML802分析天平，梅特勒-托利多公司；固相萃取裝置、Mega BE Carbon/NH2固相萃取小柱 （500 mg，6 mL），Agilent公司；50 mL離心管，Eppendorf中國有限公司；HS501搖床、Vortex Genius 3旋渦混合器，IKA集團；N-EVAP112氮吹儀，美國Organomation公司；3-18KS離心機，Sigma公司；Milli-Q超純水儀，美國Millipore公司；微孔濾膜（PTFE 0.22 μm），天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 樣品處理

1.3.1 提取

準確稱取勻漿后的桑葚樣品10.00 g（精確至0.01 g）于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈提取，置于搖床以300 r/min速率振搖30 min，再加入5 g氯化鈉，蓋上塞子，劇烈振蕩1 min，然后置于離心機中以10 000 r/min速率離心10 min，移取上清液于50mL離心管中，待凈化。

1.3.2 凈化

Mega BE Carbon/NH2固相萃取小柱先用5 mL乙腈＋甲苯（體積比為3∶1）活化。移取10 mL上述待凈化液過柱，收集濾液，再用25 mL乙腈＋甲苯（體積比為3∶1）分5次洗脫，合并洗脫液，于40℃氮吹至近干。用5.00 mL 50%甲醇水溶液定容，旋渦混合器混勻后過0.22 μm濾膜，待檢測。

1.4 儀器條件

流動相采用0.1%甲酸甲醇溶液＋0.1%甲酸水溶液＋0.1%甲酸乙腈溶液進行梯度洗脫，洗脫程序見表1。流動相使用前用超聲波脫氣。柱溫35℃，樣品室溫度16℃，進樣體積1 μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測方式進行采集。脫溶劑氣和錐孔氣均為高純氮氣，流量分別為1 000 L/h和150 L/h，碰撞氣為高純氬氣，流量為0.10 mL/min，脫溶劑溫度為500℃。定量離子對、定性離子對、毛細管電壓、錐孔電壓和碰撞電壓等相關(guān)參數(shù)見表2。

表1 測定桑葚中烯酰嗎啉殘留量的液相色譜條件

表2 質(zhì)譜參數(shù)

1.5 方法標準曲線和檢測限

用空白基質(zhì)溶液配制質(zhì)量濃度為1.00、2.00、5.00、10.00、20.00、50.00 μg/L的烯酰嗎啉基質(zhì)標樣溶液，采用1.4儀器條件進行分析。以烯酰嗎啉定量離子的峰面積（Z、E型峰面積之和）為縱坐標，基質(zhì)標樣溶液質(zhì)量濃度為橫坐標作標準曲線，用Masslynx V4.1軟件進行線性回歸分析，并求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。檢測限采用在最低濃度附近添加一系列已知濃度的雙平行樣品進行測定，采用Masslynx V4.1軟件計算烯酰嗎啉的信噪比（S/N），以S/N≥3時的樣品添加濃度為方法檢測限[33]。

1.6 方法回收率和精密度

回收率試驗采用加標回收試驗法。取桑葚空白樣品，按照添加質(zhì)量分數(shù)為1.00、10.00、50.00 μg/kg加入相應(yīng)的烯酰嗎啉標準品，每個濃度水平設(shè)6個平行樣品。所有樣品按1.3中方法進行樣品前處理，采用1.4儀器條件測定質(zhì)量濃度，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標準曲線計算樣品的實測濃度。回收率/%=樣品實測濃度/樣品理論濃度×100。精密度試驗采用加入法，參照回收率試驗方法，所有樣品連續(xù)測定3 d，根據(jù)隨行測定的基質(zhì)標準曲線計算樣品的實測濃度，采用Microsoft Excel 2010軟件計算該方法的日內(nèi)和日間精密度。

1.7 方法基質(zhì)效應(yīng)

參照Matuszewski等[34]提出的方法，基質(zhì)效應(yīng)采用比較不同條件下峰面積平均值的方法來評價。在純試劑標樣溶液（A）、桑葚空白基質(zhì)標樣溶液（B）2個條件下，分別采用3個質(zhì)量濃度（基質(zhì)濃度）1.00、10.00和50.00 μg/L來評價該方法條件下烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，每個條件下重復(fù)測定5個樣品，基質(zhì)效應(yīng)為B信號峰面積/A信號峰面積。

2 結(jié)果與討論

2.1 方法選擇性

該試驗條件下，烯酰嗎啉采用反相液相色譜分離，流動相中加入體積分數(shù)為0.10%甲酸來提高離子化效率。結(jié)果表明，桑葚基質(zhì)對桑葚樣品中烯酰嗎啉的測定干擾小，且可獲得較強的分子離子峰，Z、E型保留時間分別為5.08 min和5.18 min。桑葚空白樣品圖譜、烯酰嗎啉試劑標樣溶液圖譜、烯酰嗎啉桑葚基質(zhì)標樣溶液圖譜以及烯酰嗎啉加標樣品圖譜分別見圖1～圖4。各圖中上圖為定量離子色譜圖，下圖為定性離子色譜圖。

圖1 桑葚空白樣品圖譜

圖2 烯酰嗎啉試劑標樣溶液圖譜（1.00 μg/L）

圖3 烯酰嗎啉桑葚基質(zhì)標樣溶液圖譜（1.00 μg/L）

圖4 烯酰嗎啉加標樣品圖譜（1.00 μg/kg）

2.2 標準曲線和檢測限

該試驗條件下，烯酰嗎啉在質(zhì)量濃度1.00～50.00 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，標準曲線回歸方程為y=1.932 69×105x＋34 081.9，R2=0.999。以3倍基線噪聲的藥物濃度為檢測限，烯酰嗎啉在桑葚中的檢測限為0.25 μg/kg。以4倍方法檢測限為定量限，則桑葚中烯酰嗎啉的定量限為1.00 μg/kg。

2.3 方法回收率和精密度

該試驗條件下，烯酰嗎啉在1.00、10.00和50.00 μg/kg 3個添加質(zhì)量分數(shù)下的平均回收率分別為92.18%、95.11%、104.39%，相對標準偏差（RSD）分別為4.48%、4.31%和1.56%（見表3）。結(jié)果表明，該試驗方法在測定桑葚中烯酰嗎啉殘留量時具有較高的回收率。方法的日內(nèi)精密度RSD分別為4.85%、4.28%、3.48%，日間精密度RSD分別為5.13%、4.60%、4.27%（見表4）。結(jié)果表明，該試驗方法具有很好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

表3 方法的回收率（n=6）測定結(jié)果

表4 方法日內(nèi)精密度和日間精密度（n=6）測定結(jié)果

2.4 方法基質(zhì)效應(yīng)

采用Matuszewski等[34]提出的方法來評價烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表5。在1.00、10.00和50.00 μg/L 3個質(zhì)量濃度水平下，烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)分別為93.51%、84.81%和87.51%，RSD分別為2.35%、1.12%和0.64%。由結(jié)果可知，在質(zhì)量濃度為1.00～50.00 μg/L范圍內(nèi)，烯酰嗎啉在桑葚樣品中的基質(zhì)效應(yīng)表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)，并且隨著濃度的變化而變化。因此，在測定桑葚中烯酰嗎啉殘留量時，為避免因使用純?nèi)軇藴是€進行校正引起的分析結(jié)果偏差，應(yīng)采用基質(zhì)匹配標準溶液或工作曲線的方法進行校正。

表5 桑葚中烯酰嗎啉殘留量測定的基質(zhì)效應(yīng)（n=5）

3 結(jié)論

該試驗采用乙腈提取桑葚樣品，石墨化炭黑/氨基復(fù)合柱凈化，超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）測定其中烯酰嗎啉殘留量（基質(zhì)匹配標準曲線進行校正）。該方法前處理操作簡便，方法的選擇性、檢測限、回收率、精密度和標準曲線線性范圍及其相關(guān)系數(shù)均滿足樣品分析要求，適用于桑葚中烯酰嗎啉殘留量的測定。