禽腦脊髓炎、雞痘二聯(lián)活疫苗安全性、最小免疫劑量及免疫效力試驗(yàn)

王 紅，曹 志，毛婭卿，吳 濤，宋新宇，宮 曉，張 恒，馬 爽，李慧姣，范根成*

(1. 青島易邦生物工程有限公司 動(dòng)物基因工程疫苗國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東青島 266114；2. 中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

禽腦脊髓炎(Avian Encephalomyelitis, AE)又稱(chēng)流行性震顫，是由禽腦脊髓炎病毒(AEV)引起的一種主要危害4周齡以下雛雞，以侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)引起非化膿性腦炎為主要病理特征的病毒性傳染病[1-3]。種雞群發(fā)病期間及發(fā)病前后各1個(gè)月內(nèi)所產(chǎn)種蛋，導(dǎo)致孵化率降低并引起子代雛雞帶毒發(fā)病[4-5]。該病現(xiàn)已遍布世界各地，在我國(guó)流行日趨嚴(yán)重，但尚無(wú)有效的治療藥物，預(yù)防主要依靠疫苗免疫[6]，疫苗主要有弱毒活疫苗和滅活疫苗兩種[7-8]。目前，國(guó)內(nèi)無(wú)活疫苗，只有滅活疫苗，但生產(chǎn)廠(chǎng)家未生產(chǎn)和供應(yīng)，且2007年停止了進(jìn)口苗注冊(cè)，故市場(chǎng)上急需疫苗免疫，禽腦脊髓炎相關(guān)疫苗的研發(fā)非常必要。

雞痘(Avian Pox, AP)是由雞痘病毒引起雞和火雞的一種疾病，特征是體表無(wú)羽毛部位出現(xiàn)散在的、結(jié)節(jié)狀的增生性皮膚病灶(皮膚型)，或上呼吸道、口腔和食管黏膜出現(xiàn)纖維性壞死和增生性病灶(白喉型)，也可能同時(shí)發(fā)生全身性感染[9-10]。世界各地已廣泛流行，目前國(guó)內(nèi)只有雞痘活疫苗產(chǎn)品用于預(yù)防。

鑒于禽腦脊髓炎、雞痘活疫苗的免疫日齡相似，免疫途徑一致，且國(guó)外已有同類(lèi)產(chǎn)品注冊(cè)上市，試驗(yàn)利用有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的種毒禽腦脊髓炎YBF02株和雞痘鵪鶉化弱毒株研制成活疫苗，并進(jìn)一步對(duì)該疫苗的安全性、最小免疫劑量和免疫效力進(jìn)行了研究，以期為該疫苗生產(chǎn)和檢驗(yàn)技術(shù)參數(shù)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 疫苗 用禽腦脊髓炎YBF02株和雞痘鵪鶉化弱毒株毒種，自制3批禽腦脊髓炎、雞痘二聯(lián)活疫苗(以下簡(jiǎn)稱(chēng)“疫苗”)，批號(hào)分別為2012001、2012002、2012003。

1.1.2 攻毒用強(qiáng)毒 禽腦脊髓炎強(qiáng)毒VR株、雞痘強(qiáng)毒102株，均由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所凍干鑒定。

1.1.3 SPF雞胚、雞 SPF種蛋購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，部分孵化至6日齡(SPF雞胚)用于實(shí)驗(yàn)，部分孵化至出殼(SPF雞)，飼養(yǎng)于負(fù)壓隔離器內(nèi)。

1.2 方法

1.2.1 疫苗的安全性試驗(yàn) 將40只21日齡SPF雞隨機(jī)分為4組，10只/組，用于2012001、2012002、2012003批疫苗進(jìn)行安全性試驗(yàn)。將各批次疫苗均按瓶簽注明羽份用滅菌PBS適當(dāng)稀釋后，經(jīng)刺種途徑接種SPF雞，10羽份/只(10倍使用劑量)。最后10只不接種作為空白對(duì)照。接種后28 d內(nèi)觀(guān)察所有雞的精神、食欲、生長(zhǎng)發(fā)育是否正常，28 d時(shí)進(jìn)行稱(chēng)重，并剖檢觀(guān)察有無(wú)病理變化。

1.2.2 疫苗最小免疫劑量測(cè)定

1.2.2.1 AEV YBF02株的最小免疫劑量 取40只21日齡SPF雞隨機(jī)分為4組，每組10只。1～3組，分別刺種25 EID50、50 EID50、100 EID50的AEV YBF02株；第4組不免疫作對(duì)照。免疫后21 d，4組試驗(yàn)雞每只腦內(nèi)注射AE強(qiáng)毒VR株0.1 mL(含104.0EID50/只)。攻毒后連續(xù)觀(guān)察21 d，記錄各組發(fā)病情況，計(jì)算保護(hù)率，確定AEV YBF02株的最小免疫劑量。

1.2.2.2 雞痘鵪鶉化弱毒株的最小免疫劑量 取40只21日齡SPF雞隨機(jī)分為4組，每組10只。1～3組，分別刺種5 EID50、10 EID50、20 EID50的雞痘鵪鶉化弱毒株；第4組不免疫作對(duì)照。免疫后觀(guān)察6 d，統(tǒng)計(jì)各組痘腫率；免疫后21 d，4組試驗(yàn)雞每只腿部毛囊涂抹雞痘強(qiáng)毒102株(含100個(gè)最小發(fā)痘量)。攻毒后連續(xù)觀(guān)察14 d，記錄各組病變情況，計(jì)算保護(hù)率，確定雞痘鵪鶉化弱毒株的最小免疫劑量。

1.2.2.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

1.2.2.3.1 禽腦脊髓炎雛雞臨床癥狀 以下癥狀出現(xiàn)任何一項(xiàng)均判為發(fā)病。(1)精神沉郁、反應(yīng)遲鈍、縮脖；(2)喜臥，驅(qū)趕時(shí)共濟(jì)失調(diào)，偶爾見(jiàn)頭頸部出現(xiàn)不同程度的震顫；(3)站立困難，斜坐在跗部；(4)癱瘓或死亡。

1.2.2.3.2 雞痘臨床病變表現(xiàn) 涂抹毛囊開(kāi)始紅腫、增厚，后變黃白色干酪樣物，結(jié)血痂等融合全經(jīng)過(guò)型。

1.2.3 疫苗的免疫效力試驗(yàn)

1.2.3.1 病毒含量測(cè)定

1.2.3.1.1 AEV含量測(cè)定 將疫苗用滅菌PBS稀釋至1羽份/0.2 mL，取5 mL在2～8 ℃條件下以12000 g離心15 min；上清液經(jīng)0.22 μm濾器過(guò)濾1次，0.10 μm濾器過(guò)濾2次；取濾液再繼續(xù)作10倍系列稀釋?zhuān)?0-2、10-3、10-43個(gè)稀釋度，分別卵黃囊接種10枚6日齡SPF雞胚各10枚，每胚0.2 mL，另取10枚同批次SPF雞胚不接種作對(duì)照。37 ℃孵育(48 h內(nèi)死亡者棄去不計(jì))至正常出雛日的3 d后，統(tǒng)計(jì)其未出殼胚數(shù)、特異性死亡雛數(shù)及有禽腦脊髓炎特異性臨床癥狀的雛雞數(shù)，計(jì)算EID50。對(duì)照組應(yīng)至少8枚正常出雛，且均無(wú)禽腦脊髓炎的特異性臨床癥狀。

1.2.3.1.2 APV含量測(cè)定 將疫苗用滅菌PBS稀釋至1羽份/0.2 mL，再繼續(xù)作10倍系列稀釋?zhuān)?0-2、10-3、10-43個(gè)稀釋度，經(jīng)絨毛尿囊膜分別接種11～12日齡SPF雞胚5枚，每胚0.2 mL，置37℃孵育96～120 h時(shí)，雞胚絨毛尿囊膜水腫增厚或出現(xiàn)痘斑判為感染，計(jì)算EID50。

1.2.3.2 攻毒保護(hù)試驗(yàn) 將3批疫苗分別用滅菌PBS適當(dāng)稀釋后，每批疫苗各免疫21～35日齡SPF雞20只，每只于翅內(nèi)側(cè)無(wú)血管處皮下刺種疫苗1羽份，另取20只SPF雞不免疫作對(duì)照，分別隔離飼養(yǎng)。

1.2.3.2.1 疫苗對(duì)AEV的免疫效力評(píng)價(jià) 免疫后21 d，免疫組和對(duì)照組各隨機(jī)取10只雞，每只腦內(nèi)注射禽腦脊髓炎強(qiáng)毒VR株0.1 mL(含104.0EID50)，觀(guān)察21 d，觀(guān)察期間未出現(xiàn)“1.2.2.3.1”判定標(biāo)準(zhǔn)中禽腦脊髓炎雛雞臨床癥狀的判為免疫保護(hù)，計(jì)算免疫組保護(hù)指數(shù)(protective index, PI)。免疫組PI計(jì)算方法為攻毒對(duì)照組雞產(chǎn)生病變百分?jǐn)?shù)減去免疫組雞產(chǎn)生病變百分?jǐn)?shù)，再除以攻毒對(duì)照組雞產(chǎn)生病變百分?jǐn)?shù)，乘以100；攻毒對(duì)照雞的保護(hù)率不計(jì)算。

1.2.3.2.2 疫苗對(duì)APV的免疫效力評(píng)價(jià) 免疫后21 d，免疫組和對(duì)照組各隨機(jī)取10只，每只雞各腿部毛囊涂抹雞痘強(qiáng)毒102株0.1 mL(含100個(gè)最小發(fā)痘量)，觀(guān)察14 d，觀(guān)察期間未出現(xiàn)“1.2.2.3.2”判定標(biāo)準(zhǔn)中雞痘臨床病變表現(xiàn)的判為免疫保護(hù)，計(jì)算免疫組PI。

2 結(jié) 果

2.1 疫苗的安全性 所有試驗(yàn)雞均未發(fā)生禽腦脊髓炎、雞痘，刺種部位均出現(xiàn)痘腫(雞痘免疫成功的標(biāo)志)，精神食欲、生長(zhǎng)發(fā)育均正常；各免疫組與對(duì)照組的體重?zé)o明顯差異；剖檢所有試驗(yàn)雞臟器均未見(jiàn)異常(表1)。

表1 疫苗的安全性試驗(yàn)結(jié)果Tab 1 Safety of the combined AE and AP live vaccine

2.2 疫苗的最小免疫劑量 結(jié)果見(jiàn)表2、表3。從表2可知，AEV YBF02株以100 EID50刺種免疫21日齡SPF雞后，攻毒保護(hù)率為100%；對(duì)照組90%發(fā)病。從表3可知，雞痘鵪鶉化弱毒株以10 EID50和5 EID50分別刺種免疫21日齡SPF雞后，痘腫率分別為10/10和7/10；攻毒保護(hù)率分別為100%和70%；對(duì)照組100%雞痘病變。以上試驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，AEV YBF02株免疫100 EID50即能達(dá)到100%保護(hù)，雞痘鵪鶉化弱毒株免疫10 EID50即能達(dá)到100%保護(hù)。所以AEV YBF02株的最小免疫劑量為100 EID50，雞痘鵪鶉化弱毒株的最小免疫劑量為10 EID50。

表2 疫苗AEV YBF02株最小免疫劑量Tab 2 The minimum immune dose of the AEV (YBF02 Strain) of the vaccine

表3 疫苗雞痘鵪鶉化弱毒株最小免疫劑量Tab 3 The minimum immune dose of the APV (Quail-Adapted Strain) of the vaccine

2.3 疫苗的免疫效力

2.3.1 病毒含量測(cè)定 由表4可知，各批疫苗中AEV YBF02株病毒含量均≥103.2EID50/羽份，雞痘鵪鶉化弱毒株的病毒含量均≥103.4EID50/羽份。

2.3.2 疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果 由表5可知，3批疫苗各刺種免疫21～35日齡SPF雞，免疫后21 d進(jìn)行攻毒：腦內(nèi)攻擊AE強(qiáng)毒VR株的免疫組PI為89～100，空白對(duì)照組80%～90%發(fā)病；腿部毛囊涂抹雞痘強(qiáng)毒102株的免疫組PI均為100，空白對(duì)照組100%雞痘病變。

表4 疫苗病毒含量測(cè)定結(jié)果Tab 4 The virus content of the combined live vaccine

表5 疫苗免疫攻毒試驗(yàn)結(jié)果Tab 5 The result of the tested chickens challenged with AEV VR strain and APV 102 strain

3 討論與小結(jié)

AEV YBF02株是自行分離鑒定的一株具有高度免疫原性和嗜腸型的疫苗毒株，僅對(duì)1日齡SPF雞大劑量刺種可引起約10%發(fā)病，并可通過(guò)糞便排毒，對(duì)疫苗的安全性產(chǎn)生影響[11]。本試驗(yàn)中疫苗的安全性試驗(yàn)結(jié)果表明，疫苗對(duì)21日齡SPF雞通過(guò)刺種途徑接種10倍使用劑量是安全的。此外，有研究表明，21日齡及以上雞免疫系統(tǒng)發(fā)育已經(jīng)健全，免疫功能正常時(shí)，能夠很快產(chǎn)生免疫應(yīng)答，攻毒保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果證明了這一點(diǎn)。且該日齡段雞較易獲得，飼養(yǎng)成本也相對(duì)較低，同時(shí)對(duì)禽腦脊髓炎和雞痘均易感。因此，建議在實(shí)際疫苗檢驗(yàn)時(shí)采用21～35日齡作為疫苗的檢驗(yàn)用SPF雞日齡。

由疫苗的最小免疫劑量和病毒含量測(cè)定結(jié)果可知，3批疫苗AEV YBF02株的病毒含量為最小免疫劑量的15倍以上，雞痘鵪鶉化弱毒株的病毒含量為最小免疫劑量的250倍以上，所以疫苗中的病毒含量應(yīng)能保證免疫雞產(chǎn)生足夠的免疫效力。

APV不同劑量免疫后雞痘痘腫率和攻毒保護(hù)結(jié)果顯示，免疫10 EID50達(dá)到10/10的痘腫率和10/10攻毒保護(hù)率；免疫5 EID50達(dá)到7/10痘腫率和7/10攻毒保護(hù)率。上述結(jié)果說(shuō)明，疫苗免疫后雞痘痘腫率和攻毒保護(hù)具有很好的相關(guān)性。考慮到生物安全和檢驗(yàn)工作方便，可以用雞痘痘腫法替代免疫攻毒法進(jìn)行雞痘鵪鶉化弱毒株的效力檢驗(yàn)。

疫苗攻毒保護(hù)試驗(yàn)中2012002批疫苗AE免疫組，攻毒后10只雞中有1只發(fā)病，免疫保護(hù)9/10。雖然試驗(yàn)理論接種劑量為1羽份/只，超過(guò)最小免疫劑量多倍，但是整個(gè)免疫攻毒保護(hù)試驗(yàn)過(guò)程中，可能會(huì)受到雞個(gè)體差異、進(jìn)入雞體內(nèi)有效免疫劑量、強(qiáng)毒株的有效攻毒劑量和試驗(yàn)操作等因素的影響，導(dǎo)致免疫組中個(gè)別雞沒(méi)有達(dá)到理想的免疫效果。這種現(xiàn)象在試驗(yàn)中是可能存在的，此試驗(yàn)數(shù)據(jù)將會(huì)為制定疫苗效力檢驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。