豬瘟抗體膠體金快速定量檢測(cè)卡的研制

李成洪，宋青龍，王曉中，唐 達(dá)，傅 巍，楊春柳

(1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460，2.北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司，北京 100193； 3.國(guó)家飼料工程技術(shù)研究中心，北京 100193)

豬瘟是由豬瘟病毒(CSFV)引起的一種急性、發(fā)熱、具有高度傳染性的疫病，在自然條件下只感染豬，不同年齡、性別、品種的豬和野豬都易感，一年四季均可發(fā)生，且病死率高，傳播迅速，蔓延地區(qū)廣，對(duì)養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了極大威脅。本病在1833年首次發(fā)現(xiàn)于美國(guó)，之后其流行遍及全球，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。20世紀(jì)50年代，我國(guó)豬瘟兔化弱毒疫苗問世后，對(duì)豬瘟的控制主要依賴于疫苗免疫，因此，疫苗免疫效果的優(yōu)劣對(duì)豬瘟防控起了決定性作用，而豬瘟抗體水平的監(jiān)測(cè)是疫苗免疫效果評(píng)價(jià)的主要方法[2]。目前市場(chǎng)上檢測(cè)豬瘟抗體的產(chǎn)品主要是進(jìn)口的ELISA試劑盒[3]，但其價(jià)格昂貴，需要專業(yè)人員操作，且檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)[4]。而現(xiàn)有的豬瘟抗體膠體金及熒光免疫層析檢測(cè)卡，只能做定性檢測(cè)[5]，即根據(jù)T線的有無(wú)判定樣本中豬瘟抗體的陰陽(yáng)性[6-8]。這種判定憑肉眼觀察[9-10]，主觀性較強(qiáng)，且結(jié)果對(duì)于疫苗免疫效價(jià)的評(píng)定意義不大。因此，應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)，結(jié)合膠體金定量讀數(shù)儀，進(jìn)行了快速定量豬瘟抗體檢測(cè)卡的研制，以期可快速定量檢測(cè)豬血清中豬瘟抗體水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 氯金酸(HAuCl4·4H2O)，國(guó)藥；豬瘟重組E2蛋白，北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司；羊抗鼠IgG、小鼠IgG，上海金標(biāo)生物科技有限公司；硝酸纖維素膜，Millipore；膠體金結(jié)合墊、樣品墊、吸水紙，上海金標(biāo)生物科技有限公司；豬瘟病毒抗體檢測(cè)試劑盒(ELISA)，IDEXX；豬圓環(huán)病毒病陽(yáng)性血清、豬偽狂犬病陽(yáng)性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽(yáng)性血清、豬乙型腦炎陽(yáng)性血清、待檢血清，重慶市畜牧科學(xué)院。

1.1.2 儀器設(shè)備 三維平面點(diǎn)膜噴金儀HM3030，上海金標(biāo)生物科技有限公司；微電腦自動(dòng)斬切機(jī)ZQ2000，上海金標(biāo)生物科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)H-2050R，長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；紫外連續(xù)掃描分光光度計(jì)，Thermo；數(shù)顯磁力攪拌電熱套，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；手持式膠體金定量讀數(shù)儀，深圳元秦科技有限公司；電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 膠體金溶液的制備 在圓底燒瓶中加入1 L超純水加熱至煮沸，加入10 mL 1%氯金酸溶液，2 min后加入12 mL 1%檸檬酸三鈉溶液，此時(shí)溶液顏色由黑色逐漸變?yōu)榫萍t色。繼續(xù)煮沸15 min后停止加熱，冷卻至室溫，4 ℃貯存。紫外掃描檢測(cè)膠體金溶液質(zhì)量。

1.2.2 抗原最佳標(biāo)記pH值的確定 取1 mL膠體金溶液，分別加入1、3、5、8、10、15、20 μL濃度為0.2 mol/L的碳酸鉀(K2CO3)溶液調(diào)節(jié)pH值[11]，豬瘟重組E2蛋白按照0.02 mg/mL標(biāo)記，終濃度1% BSA封閉，離心去上清液后用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)洗滌一次，再次離心后用150 μL懸浮液懸浮。小鼠IgG按照0.01 mg/mL標(biāo)記后，與標(biāo)記好的抗原等體積混勻。混合液按10 μL/cm噴金量包被在膠體金結(jié)合墊上，37 ℃干燥2 h。

豬瘟重組E2蛋白和羊抗鼠IgG分別稀釋到1.0 mg/mL，按1 μL/cm劃膜量包被到NC膜上，37 ℃干燥1 h。組裝大板、切條，用豬瘟病毒弱陽(yáng)性血清檢測(cè)，觀察T線顯色情況，選擇沒有死金的且顯色最強(qiáng)的K2CO3溶液用量作為最佳標(biāo)記pH值。

1.2.3 抗原最佳標(biāo)記濃度與最佳包被濃度的確定

用確定的最佳標(biāo)記pH值，豬瘟重組E2蛋白分別按照0.01、0.02、0.03、0.04 mg/mL標(biāo)記，小鼠IgG按照0.01 mg/mL標(biāo)記。豬瘟重組E2蛋白分別按照0.2、0.4、0.8、1.0 mg/mL包被在T線位置，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)豬瘟病毒陽(yáng)性血清、弱陽(yáng)性血清和陰性血清。選擇弱陽(yáng)性血清顯色明顯且陽(yáng)性血清與弱陽(yáng)性血清顯色差異最大的組合為最佳條件。在此條件下，羊抗鼠IgG按照分別按照0.8、1.0、1.2、1.4 mg/mL包被在C線位置，檢測(cè)豬瘟病毒陽(yáng)性血清，選擇C線顯色強(qiáng)度與T線相當(dāng)?shù)陌粷舛葹樽罴褩l件。

將包被有豬瘟重組E2蛋白和羊抗鼠IgG的硝酸纖維素膜、噴有豬瘟重組E2蛋白偶聯(lián)膠體金的聚酯墊、玻璃纖維濾紙與吸水紙組裝在PVC底板上，用切條機(jī)切成4.0 mm寬的試紙條，裝入檢測(cè)卡殼中，即為最終的檢測(cè)卡。

1.2.4 樣品檢測(cè)方法的確定 將豬瘟陽(yáng)性血清、弱陽(yáng)性血清、陰性血清分別取50、80、100、150 μL加到加樣孔中，室溫反應(yīng)10、13、15、20 min觀察結(jié)果，確定加樣量及反應(yīng)時(shí)間。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 用豬瘟陰性血清按梯度稀釋陽(yáng)性血清，用ELISA試劑盒檢測(cè)并計(jì)算其阻斷率，分別取80 μL加到檢測(cè)卡的加樣孔中，室溫反應(yīng)15 min，放入膠體金定量讀數(shù)儀中，讀取T線與C線的峰面積比值即T/C值，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，計(jì)算平均值。以T/C值平均值為橫坐標(biāo)、血清樣本阻斷率為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 結(jié)果判定方法的建立 檢測(cè)卡檢測(cè)20份豬瘟抗體陰性血清，用定量讀數(shù)儀讀取T/C值，計(jì)算cutoff值。檢測(cè)臨床樣本的T/C值小于該值判定為陰性，大于該值同時(shí)小于阻斷率為40血清樣本對(duì)應(yīng)的T/C值為灰區(qū)，大于阻斷率為40血清樣本對(duì)應(yīng)的T/C值的樣本則以定量讀數(shù)儀結(jié)果為最終結(jié)果。

1.2.7 檢測(cè)卡特異性檢測(cè) 豬瘟檢測(cè)卡分別檢測(cè)豬圓環(huán)病毒病陽(yáng)性血清、豬偽狂犬病陽(yáng)性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽(yáng)性血清、豬乙型腦炎陽(yáng)性血清，確定本檢測(cè)卡的特異性。

1.2.8 檢測(cè)卡重復(fù)性及加速穩(wěn)定性檢測(cè) 檢測(cè)卡分別檢測(cè)豬瘟抗體陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性血清，每份血清樣本重復(fù)檢測(cè)5次，考察其重復(fù)性。將檢測(cè)卡放置于45 ℃溫箱中，分別于第0、2、4、6、8周檢測(cè)豬瘟抗體陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性血清，考察檢測(cè)卡的穩(wěn)定性。

1.2.9 樣本檢測(cè) 隨機(jī)選取71份豬血清樣本，分別用ELISA試劑盒和本檢測(cè)卡檢測(cè)豬瘟抗體水平，比較檢測(cè)結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠體金溶液掃描結(jié)果 以雙蒸水為對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)在400～700 nm連續(xù)掃描，測(cè)定吸收曲線和吸收峰，結(jié)果為：λmax=527 nm，ODmax=0.109。所制備的膠體金溶液顆粒大小在40 nm左右，顏色為透明的酒紅色，液面無(wú)油質(zhì)類漂浮物，可用于試紙條制備。

2.2 抗原最佳標(biāo)記pH值 膠體金中加入5 μL 0.2 mol/L K2CO3溶液調(diào)節(jié)pH值時(shí)，標(biāo)記抗原沒有死金現(xiàn)象，且顯色最強(qiáng)，調(diào)節(jié)后的膠體金溶液的pH值在8.0左右。

2.3 抗原最佳標(biāo)記濃度與最佳包被濃度 通過正交實(shí)驗(yàn)，確定豬瘟重組E2蛋白和小鼠IgG分別按0.01 mg/mL標(biāo)記、T線豬瘟重組E2蛋白按照0.8 mg/mL包被、C線羊抗鼠IgG按照1.0 mg/mL包被為最佳條件組合。

2.4 樣品檢測(cè)方法的確定 取血清樣本80 μL加到加樣孔中，室溫反應(yīng)10 min，為樣本的檢測(cè)條件。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 通過檢測(cè)梯度稀釋的陽(yáng)性血清，確定線性范圍及對(duì)應(yīng)的T/C值。以T/C值平均值為橫坐標(biāo)、陽(yáng)性樣本阻斷率為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

2.6 結(jié)果判定方法的建立 檢測(cè)卡檢測(cè)20份豬瘟抗體陰性血清，用定量讀數(shù)儀讀取T/C值，計(jì)算cutoff值為0.035。確定檢測(cè)臨床樣本的T/C值小于0.035判定為陰性，大于0.035同時(shí)小于0.331判定為灰區(qū)，大于0.331的則以定量讀數(shù)儀結(jié)果為最終結(jié)果。

2.7 檢測(cè)卡的特異性 本檢測(cè)卡檢測(cè)豬圓環(huán)病毒病陽(yáng)性血清、豬偽狂犬病陽(yáng)性血清、豬繁殖與呼吸綜合征陽(yáng)性血清、豬乙型腦炎陽(yáng)性血清，結(jié)果均為陰性(圖2)，說(shuō)明檢測(cè)卡與以上疫病抗體無(wú)交叉反應(yīng)。

圖1 豬瘟抗體快速定量檢測(cè)卡標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig 1 Standard curve of CSF rapid and quantitative test card

a.豬瘟陽(yáng)性對(duì)照，CSF；b.豬圓環(huán)病毒病，PC；c.豬偽狂犬病，PR；d.豬繁殖與呼吸綜合征，PRRS；e.豬乙型腦炎，JE

2.8 檢測(cè)卡重復(fù)性結(jié)果 用同批次檢測(cè)卡分別檢測(cè)豬瘟抗體陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性血清，每個(gè)濃度重復(fù)檢測(cè)5次，批內(nèi)重復(fù)性結(jié)果見表1。結(jié)果表明，豬瘟抗體檢測(cè)卡的批內(nèi)重復(fù)性好，無(wú)明顯差異。

表1 檢測(cè)卡批內(nèi)重復(fù)性Tab 1 Intra repeatability of CSF rapid and quantitative test card

2.9 檢測(cè)卡加速穩(wěn)定性結(jié)果 將檢測(cè)卡放置于45 ℃溫箱中，于第0、2、4、6、8周檢測(cè)豬瘟抗體陰性、弱陽(yáng)性、陽(yáng)性血清，其穩(wěn)定性結(jié)果見表2。可以看出，檢測(cè)卡在45 ℃下保存8周其檢測(cè)結(jié)果無(wú)明顯差異，可依此確定檢測(cè)卡室溫保質(zhì)期最少為6個(gè)月。

2.10 樣品檢測(cè)結(jié)果 檢測(cè)卡和ELISA試劑盒檢測(cè)71份樣本中豬瘟抗體結(jié)果見表3。部分樣本具體對(duì)比結(jié)果見表4。

表2 檢測(cè)卡穩(wěn)定性Tab 2 Stability of CSF rapid and quantitative test card

表3 檢測(cè)卡與ELISA檢測(cè)豬瘟抗體結(jié)果符合情況Tab 3 The detected results of the test card and ELISA

表4 豬瘟抗體定量檢測(cè)卡檢測(cè)樣本結(jié)果Tab 4 Detection results of CSF rapid and quantitative test card

由表3可見，相對(duì)ELISA檢測(cè)法，定量檢測(cè)卡檢測(cè)陽(yáng)性為40份，陰性為31份，假陽(yáng)性為2份，假陰性為5份。定量檢測(cè)卡的靈敏度為88.4%，特異性為92.9%，總符合率為90.1%。

由表4可見，定量檢測(cè)卡檢測(cè)豬瘟抗體陽(yáng)性樣本的阻斷率與ELISA結(jié)果有較好的符合度，相對(duì)誤差在15%以內(nèi)。

3 討 論

豬瘟是妨礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要疫病之一，在豬瘟的防疫中，豬瘟抗體水平的檢測(cè)是十分必要的，其高低反應(yīng)了豬對(duì)豬瘟病毒的抵抗能力及疫苗免疫效果。目前主要用ELISA試劑盒檢測(cè)豬瘟抗體水平，但其檢測(cè)時(shí)間通常需要1.5～3 h[12-13]。實(shí)驗(yàn)研制的膠體金定量檢測(cè)卡結(jié)合手持式定量讀數(shù)儀，其操作簡(jiǎn)便、步驟單一，加樣80 μL后反應(yīng)只需10 min，即可讀取T/C值及對(duì)應(yīng)的阻斷率，避免了人為主觀判斷造成的差異，適用于單個(gè)及多個(gè)樣本的檢測(cè)。與ELISA結(jié)果相比，檢測(cè)卡靈敏度為88.4%，特異性為92.9%，總符合率為90.1%。檢測(cè)陽(yáng)性樣本的阻斷率與ELISA結(jié)果的相對(duì)誤差在15%以內(nèi)，符合度較好。同時(shí)檢測(cè)卡只需常溫儲(chǔ)存，加速穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明45 ℃條件下8周其結(jié)果差異仍小于15%，相當(dāng)于常溫放置6個(gè)月。實(shí)驗(yàn)研制的豬瘟抗體快速定量檢測(cè)卡使用方便、快速，成本低，可用于豬瘟抗體的快速檢測(cè)，適合基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖企業(yè)使用。