HPLC測定維生素ADE注射液中三種維生素的含量

吳春燕，張金寶，劉海艷，李文財，馮 巖，王 莉，任建軍，張玉彥*

(1.寧夏獸藥飼料監察所，銀川 750011；2. 西北農林科技大學動物科技學院，楊凌 712100；3. 寧夏智弘生物科技有限公司，銀川 750021)

維生素ADE注射液是以維生素A、維生素D和維生素E為主藥，輔以其他溶劑，制備成的營養補充類物質，用于預防和治療動物維生素A、維生素D和維生素E缺乏癥[1-3]，該制劑正在申報5.1類新獸藥。目前，測定脂溶性維生素A、維生素D3和維生素E的方法主要包含分光光度法和HPLC法[4-5]，其中分光光度法是通過測定吸收度而確定樣品含量，因樣品中的輔料會對吸收度造成干擾而影響含量檢測，須經過皂化和提取等預處理過程后進行檢測；HPLC法具有靈敏度高、操作簡單和重現性好等特點，但是樣品同樣須經過繁瑣的預處理過程后，方能進行含量檢測。根據維生素A、維生素D3和維生素E均溶于乙醇的物理特性，結合相似相溶原理，采用無水乙醇直接提取的方法，并建立了以甲醇為流動相A、乙腈-乙醇-水(60∶25∶5)為流動相B的反相HPLC法，能有效分離維生素A、維生素D3和維生素E，來滿足實際生產過程中對檢驗時間及結果的需求。結果表明該方法操作簡單、結果準確，可用于成品及中間體的檢測。

1 材 料

1.1 儀器 上海梅特勒托利多儀器有限公司AB265-S電子天平；日本島津LC-2010C高效液相色譜儀。

1.2 試藥與試劑 維生素A棕櫚酸酯對照品，購自德國J&K Scientific Ltd，批號為LJ10P49，含量1790,000 U/g；維生素D3對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號為100061-201208，含量99.8%；維生素E對照品，購自中國食品藥品檢定研究院，批號為100062-201110，含量97.7%；維生素ADE注射液，寧夏智弘生物科技有限公司生產，批號為20121001，規格 10 mL：維生素A 1,000,000 U+維生素D3 100,000 U+維生素E 3,000 U；所有試劑均為色譜級。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；甲醇為流動相A，乙腈-乙醇-水(60：25：5)為流動相B，按表1進行梯度洗脫；檢測波長為265 nm；流速為1.5 mL/min；柱溫為室溫；進樣量為20 μL。

表1 梯度洗脫

2.2 溶液的配制

2.2.1 對照品溶液 精密稱取維生素A棕櫚酸酯對照品、維生素D3對照品和維生素E對照品各適量，用無水乙醇制成每1 mL中約含維生素A棕櫚酸酯1000 U、維生素D3 100 U、維生素E 3 U的溶液，濾過，即得。

2.2.2 供試品溶液 精密量取本品1 mL，置100 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 方法學考察

2.3.1 專屬性 精密吸取20 μL空白溶劑、陰性溶液(不含主藥)、對照品溶液和供試品溶液，按上述色譜條件，注入色譜儀，記錄色譜圖，結果如圖1所示，空白溶劑及陰性溶液對三種組分含量測定無干擾。

(a：空白溶劑圖譜；b：陰性溶液圖譜；c：對照品圖譜；d：供試品圖譜)

2.3.2 線性 精密稱定維生素A棕櫚酸酯、維生素D3、維生素E對照品適量，加無水乙醇制成每1 mL中含維生素A棕櫚酸酯6096 μg、維生素D3 256 μg、維生素E 30023 μg的混合液，精密量取上述對照品混合液0.1、0.2、0.6、1.0、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過。按上述色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖。以樣品濃度為x(μg/mL)，平均峰面積為y，進行線性回歸。結果回歸方程(n=7)和相關系數分別為維生素Ay=7.3235x+24.297，r2=1；維生素D3y=4.5714x+0.77738，r2=0.99995；維生素Ey=1.2036x+33.179，r2=0.9999。實驗結果表明，維生素A、維生素D3和維生素E分別在60.96～1219.20 μg/mL、2.56～51.20 μg/mL和300.23～6004.60 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.3.3 準確度 精密量取對照品溶液40 mL、50 mL和60 mL各3份分別置100 mL量瓶中，再分別精密量取0.50 mL供試品加入至上述各100 mL量瓶中，加無水乙醇至刻度，搖勻，濾過，即得樣品溶液。供試品溶液作為本底溶液。按上述色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，結果如表2，平均回收率大于99%，說明檢測方法的準確度良好。

表2 準確度結果

2.3.4 精密度

2.3.4.1 重復性試驗 取6份供試品，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中三種維生素的含量，結果如表3，RSD均小于1.0%，說明重復性良好。

表3 重復性結果

2.3.4.2 中間精密度 由A、B、C三人，分別取2份供試品，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，測定供試品溶液中三種維生素的含量，結果如表4，RSD均小于0.5%，說明精密度良好。

表4 中間精密度結果

2.3.5 穩定性 取1份供試品，照2.2.2項下方法制備供試品溶液，分別在0、3、6、9、12 h進樣20 μL，測定供試品溶液中三種維生素的含量， 結果如表5，RSD均小于1.0%，說明制備后12小時內測定基本穩定。

2.3.6 耐用性 考察不同的流動相、柱溫和流速對含量測定的影響，按上述色譜條件，精密量取20 μL，注入色譜儀，記錄色譜圖，結果如表6，在流動相、柱溫和流速出現小的變動時，含量測定基本不受影響。

表5 穩定性結果(n=4)

表6 耐用性-流動相、柱溫、流速結果

3 討 論

3.1 檢測方法的選擇 截止到目前，維生素的分析方法主要包含微生物法、生物鑒定法、化學法和儀器法四大類[6]，其中微生物法僅用于測定水溶性維生素的含量，生物鑒定法用于分析樣品生物利用率，化學法用于特定維生素的檢測，儀器法用途較為廣泛。隨著科技的不斷發展，高效液相色譜法已逐步成為常規的含量檢測手段，該方法具有快速、靈敏等特點[7]。本文研究的HPLC法能夠在40 min內，有效分離維生素A、維生素D3和維生素E，滿足了實際生產過程中對檢驗時間及結果的需求。

3.2 提取方式的選擇 目前，脂溶性維生素的提取方式主要以皂化法為主，通過皂化法處理樣品，水洗去除類脂物后，用有機溶劑提取脂溶性維生素，濃縮后將樣品溶于適當的溶劑中進行測定[8]。在整個提取過程中，為了避免維生素的氧化降解，通常采用加入抗氧劑、充氮氣和避光等方法進行操作。由此可見，采用皂化法進行脂溶性維生素的預處理，是較為繁瑣的過程，同時整個過程中容易出現提取不完全的現象，并且過程的復雜性對含量結果的準確度具有很大影響，因此選擇更簡單、快速的提取方式，是進行脂溶性維生素檢測所需要關注的重點方向。根據維生素A、維生素D3和維生素E均溶于乙醇的物理特性，結合相似相溶原理，采用無水乙醇直接提取的方法進行含量測定，通過方法學驗證結果說明該提取方法是可行的。

3.3 檢測波長的選擇 根據文獻報道，結合實際紫外可見全波段掃描發現，維生素A、維生素D3、維生素E的最大吸收波長分別為325 nm、265 nm和290 nm[9]，樣品中維生素D3的占比較小，而且在265 nm波長處維生素A和維生素E具有較好吸收。因此，選擇265 nm吸收波長作為檢測波長[10-11]，既降低了對檢測器的要求，擴大了方法的適用性，又滿足了三種維生素的檢測靈敏度要求，最終達到了簡化檢測方法的目的。

3.4 流動相的選擇 采用HPLC法檢測脂溶性維生素常用的流動相有甲醇、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、異丙醇和水等組成[12-14]。本研究先后采用甲醇-水、乙腈-乙醇-水和梯度洗脫等方式，發現以甲醇為流動相A，乙腈-乙醇-水(60∶25∶5)為流動相B，進行梯度洗脫時，維生素A、維生素D3和維生素E能有效分離、峰型對稱、無干擾，并且通過方法學驗證結果說明該流動相是合適的。

4 結 論

HPLC法測定維生素ADE注射液中維生素A、維生素D3和維生素E含量方法可行，供試品溶液三個主峰的保留時間與對照品相應三個主峰的保留時間一致，樣品分離效果較好，有很好的專屬性、準確度、重復性、中間精密度、穩定性和耐用性。