高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的不確定度評定

葉文姣

摘要 本文通過高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量，同時依據(jù)《測量不確定度評定與表示》（JJF 1059—1999），分析其不確定度來源和建立數(shù)學(xué)模型，量化不確定度分量，計算合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴展不確定度。結(jié)果顯示，樣品中喹乙醇代謝物的含量為（80.01±0.31）μg/kg，擴展不確定度為0.31 μg/kg（k=2），其中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度為主要來源。

關(guān)鍵詞 高效液相色譜法；水產(chǎn)品；喹乙醇代謝物；不確定度評定

中圖分類號 O657.7+2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-5739（2018）11-0243-02

喹乙醇又稱喹酰胺醇，屬于喹噁啉類動物專用藥，具有廣譜抗菌、促進蛋白同化、加快動物生長及提高飼料轉(zhuǎn)化率的作用，廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1-3]。其在動物體內(nèi)的主要代謝物為3-甲基喹噁啉-2-羥酸（MQCA），具有明顯的蓄積毒性，對人體也有致畸、致癌、致突變作用[4]。因此，美國和歐盟均禁止喹乙醇作為飼料添加劑。《中國獸藥典》（2005版）也明確規(guī)定禁止喹乙醇用于家禽及水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。

不確定度可用于衡量化學(xué)分析中測量結(jié)果的可信程度，是評定檢測數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度與真實性的重要指標(biāo)。通過分析不確定度的來源、分量大小，可以明確測定過程中各因素對測量結(jié)果不確定度的影響程度，進而提高測量結(jié)果的準(zhǔn)確性[5-7]。

本試驗采用農(nóng)業(yè)部1077號公告-5-2008《水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測定 高效液相色譜法》進行測定，當(dāng)MQCA的檢測結(jié)果在限量值附近時，對測定過程中的不確定度評定是判定樣品合格與否的重要依據(jù)[8]。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，配紫外-可見光檢測器（美國Agilent公司）。采用農(nóng)業(yè)部1077號公告-5-2008《水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的測定 高效液相色譜法》進行樣品提取與純化。色譜條件為色譜柱：C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇+1.0%甲酸水溶液（50+50）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：50 μL；檢測波長：320 nm。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制作

準(zhǔn)確稱取MQCA標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL置于棕色容量瓶中，配成濃度為100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。再用流動相稀釋成為0.01、0.05、0.25、0.50、1.00 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，供高效液相色譜分析待用，然后用外標(biāo)法定量。

1.3 數(shù)學(xué)模型

數(shù)學(xué)模型如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度的來源分析

重復(fù)測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（1）主要為樣品處理過程的一致性，樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（2）主要為天平準(zhǔn)確性和稱量過程變動性，樣品定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（3）包括樣品定容所用吸量管，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度urel（4）包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的不確定度，其他不確定度還有高效液相色譜儀測量的不確定度urel（5）和回收率影響引入的不確定度urel（6）。

2.2 不確定度的分量評定

2.2.1 重復(fù)測定引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。對同一陰性試樣加標(biāo)樣品進行前處理和色譜測定，平行測定9次，其結(jié)果見表1。

2.2.2 樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。樣品稱量所用天平為最小分度值為0.01 g的電子天平，準(zhǔn)確稱量m=5.00 g。根據(jù)校準(zhǔn)證書，測量結(jié)果的擴展不確定度U=0.01 g，k=2，則樣品稱量引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（2）=0.01/2/5.00=0.001。

2.2.3 樣品定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。樣品經(jīng)提取、氮氣吹干后，殘留物用1 mL流動相定容。定容采用1 mL單標(biāo)線吸量管（A級），根據(jù)校準(zhǔn)證書可知，其擴展不確定度U=0.02 mL，k=2，則樣品定容引入的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（3）=0.02/2/1=0.01。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度包含標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度、標(biāo)準(zhǔn)儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程引入的不確定度。

（1）標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度評定。標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)MQCA由Dr.Ehrenstorfer提供，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書提供的信息，MQCA純度為99.0%，不確定度為±0.5%，在95%的置信概率下，包含因子 k=2，屬 B類評定，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度：urel（4.1）=0.5%/2/99.0%=0.002 525。

（2）標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制過程引入的不確定度評定。標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制過程是精確稱取 0.010 0 g MQCA，用甲醇溶液溶解并定容至100 mL，質(zhì)量濃度為100 mg/L。根據(jù)稱量使用的電子天平校準(zhǔn)證書，擴展不確定度U=0.003 0 g，包含因子k=2，稱標(biāo)樣量為0.010 0 g，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（4.2.1）=0.003 0 g/2/0.010 0 g=0.150 0。

該過程使用的玻璃量具按照《常用玻璃量器檢定規(guī)程》（JJG 196—2006）的校準(zhǔn)依據(jù)[9]，得到擴展不確定度U=0.04 mL，k=2。100 mL容量瓶（A級）的相對不確定度urel（4.2.2）=0.04 mL /2/100 mL=0.000 2。因此，標(biāo)準(zhǔn)儲備液引入的相對不確定度為：

（3）標(biāo)準(zhǔn)工作液配制過程產(chǎn)生的不確定度評定。標(biāo)準(zhǔn)工作液是由MQCA標(biāo)準(zhǔn)儲備液逐級稀釋得到的質(zhì)量濃度分別為0.005、0.010、0.050、0.500、1.000 μg/mL。標(biāo)準(zhǔn)工作液制備過程使用了一系列玻璃量具，其擴展不確定度及擴展因子見表2。因此，標(biāo)準(zhǔn)工作液引入的相對不確定度為：

綜合以上3項，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.2.5 高效液相色譜儀測量的不確定度。由Agilent 1200高效液相色譜儀校準(zhǔn)證書得到儀器測量的擴展不確定度U=5%，k=2，則其相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（5）=5%/2=0.025。

2.2.6 回收率影響產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度。樣品在前處理過程中，因乙酸乙酯反復(fù)提取、氮氣吹干及光照、溫度、人員操作、進樣檢測儀器誤差等原因產(chǎn)生損失。本文以回收率偏差產(chǎn)生的相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（6）來計算樣品前處理中其他因素產(chǎn)生的不確定度。添加濃度為80 μg/kg，n=9。檢測項目為MQCA，回收率范圍70.73%～83.7%，回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差（S）4.315 7%，平均回收率74.98%，相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度urel（6）0.19 19。

使用t檢驗法檢驗平均回收率與其期望值1.0的差異，

2.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度

按公式對以上分量分成，其合成相對標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.4 擴展不確定度

取置信水平95%，k=2，則水產(chǎn)品中MQCA測定的擴展不確定度為：

U=k×urel（x）=2 ×0.155 2=0.31。

2.5 測定結(jié)果

試驗采用高效液相色譜法對水產(chǎn)品中MQCA殘留量進行測定，當(dāng)取樣量為5.00 g，k=2（95%置信度），試驗測得樣品中MQCA的最佳估算值為80.01 μg/kg。因此，測量結(jié)果報告為（80.01±0.31）μg/kg。

3 結(jié)論

本文對高效液相色譜法測定水產(chǎn)品中喹乙醇代謝物殘留量的不確定度來源進行全面分析，將各不確定度的分量進行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度對測定結(jié)果不確定度的影響最大，其次為高效液相色譜儀測量的不確定度，其他因素影響較小。因此，在測定過程中，為獲得較小的不確定度，應(yīng)進一步規(guī)范標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的配制，盡量選取純度較高的標(biāo)準(zhǔn)品，使用A級玻璃量具，定期對天平及高效液相色譜儀等儀器進行維護保養(yǎng)與校準(zhǔn)，從而提高試驗操作的規(guī)范性與測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。

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