Ad(E1-).sT 治療乳腺癌移植瘤的作用及體內免疫激活效應

王浩，楊月峰，胡澤斌，王華，肖鳳君，王立生

乳腺癌是最為常見的女性惡性腫瘤之一，在美國，乳腺癌占女性癌癥死亡率的第二位；而我國乳腺癌的發病率位居女性癌癥發病率之首[1-2]。晚期乳腺癌患者往往會發生骨轉移，嚴重影響患者的生活質量和預期壽命。2015 年 10 月，美國 FDA批準了攜帶粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）的單純皰疹溶瘤病毒上市，基因治療和溶瘤病毒治療成為腫瘤治療研究的熱點[3]。本實驗室長期從事溶瘤腺病毒的基礎研究，研發了多種溶瘤腺病毒載體[4-8]。其中，攜帶可溶性轉化生長因子（transforming growth factor β，TGF-β）受體 II-人IgGFc 融合蛋白（sTGFβRIIFc）的溶瘤腺病毒Ad.sT，可有效抑制乳腺癌（MDA-MB-231）骨轉移的進展[4]。但是，對于 sTGFβRIIFc 基因的體內免疫調節作用與機制尚未做系統分析。

在具有完全免疫系統的乳腺癌細胞 4T1 移植瘤模型中，采用瘤內給藥方式給予攜帶sTGFβRIIFc 基因的復制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT和對照病毒 Ad(E1-).Null 進行治療，明確Ad(E1-).sT 的治療效果；研究 Ad(E1-).sT 對小鼠血象的調控作用；分析 Ad(E1-).sT 對小鼠外周血T 淋巴細胞亞群和小鼠脾臟樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的激活效應。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 小鼠乳腺癌細胞 4T1 購自美國ATCC 公司，培養于 10% 胎牛血清（FBS）的 1640培養基中。

1.1.2 重組腺病毒 攜帶可溶性 TGF-β 受體 II-人 IgGFc 融合蛋白（sTGFβRIIFc）的復制缺陷型重組腺病毒 Ad(E1-).sT 和不攜帶外源基因的對照病毒 Ad(E1-).Null 均由本實驗室采用 Adeasy 系統制備獲得。大量擴增獲得的病毒原液，經氯化銫密度梯度離心，獲得高質量的病毒，其顆粒滴度大于 1 × 1012VPs/ml，純度（OD260/OD280）在 1.25 ～1.45 之間。

1.1.3 實驗動物 動物模型為小鼠皮下移植瘤模型，4 ～ 6 周齡、雌性、BALB/c 小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物合格證編號為：SCXK（京）2012-0001，飼養于軍事科學院軍事醫學研究院動物房。動物實驗方案和操作流程均經軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所倫理委員會批準并嚴格執行。

1.1.4 主要試劑與儀器 APC 標記的大鼠抗小鼠 CD3e 抗體（APC-CD3e）、PE 標記的大鼠抗小鼠 CD4 抗體（PE-CD4）、FITC 標記的大鼠抗小鼠 CD8 抗體（FITC-CD8a）、FITC 標記的大鼠抗小鼠 CD11c 抗體（FITC-CD11c）和 PE 標記的大鼠抗小鼠 CD86 抗體（PE-CD86）均購自美國eBioscience 公司；紅細胞裂解液、流式細胞儀FACScalibur 均購自美國 BD 公司；血細胞計數儀購自華鑫科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠乳腺癌細胞皮下移植瘤模型建立 對數生長期的小鼠乳腺癌細胞 4T1 經胰酶消化、收集后，用預冷的 PBS 洗滌 2 次；將 4T1 細胞按照每只 BALB/c 小鼠 2 × 106個/100 μl PBS 的量進行皮下接種。檢測小鼠腫瘤生長情況，當小鼠腫瘤生長至綠豆大時進行治療。

1.2.2 Ad(E1-).sT 治療 4T1 移植瘤的療效評價 荷瘤后第 7 天，測定腫瘤體積，將成瘤小鼠按腫瘤體積進行隨機分組，分為 Buffer 治療組、Ad(E1-).Null 治療組和 Ad(E1-).sT 治療組，分別瘤內給予 PBS（100 μl）、Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT（2.5 × 1010VPs/100 μl PBS）進行治療；荷瘤后第10 天，重復治療一次（病毒劑量同第一次）。第 7、12、15、19 天分別檢測腫瘤的體積，繪制腫瘤生長曲線；第 19 天，處死小鼠，剝離腫瘤并測定重量。

1.2.3 Ad(E1-).sT 治療對小鼠血象的影響 荷瘤后第 12 天和第 18 天，分別采用內眥靜脈取血方式，收集抗凝的小鼠外周血 100 μl；取 20 μl 血樣，進行小鼠血象分析，分別測定小鼠淋巴細胞（W-SCC）、粒細胞（W-LCC）和中間細胞（W-MCC）的數量。

1.2.4 Ad(E1-).sT 治療對小鼠外周血 T 淋巴細胞亞群的影響 將收集的抗凝外周血 50 μl 標記APC-CD3e、PE-CD4 和 FITC-CD8a，室溫避光放置 30 min；加入 2 ml 1 × 紅細胞裂解液，室溫放置 10 min；離心收集細胞，并用 PBS 洗滌 2 次，收集細胞后，采用流式細胞術檢測 CD4+T 淋巴細胞和 CD8+T 淋巴細胞的比例。

1.2.5 Ad(E1-).sT 治療對小鼠脾臟中樹突狀細胞的影響 第 19 天，處死小鼠并剝離腫瘤后，收集小鼠脾臟；將脾臟剪碎并研磨后，過 70 μm 尼龍膜，離心收集細胞；加入 5 ml 1 × 紅細胞裂解液，37 ℃ 水浴放置 5 min，充分裂解紅細胞。收集細胞后，用 PBS 洗滌 2 次，進行細胞計數，計算脾臟細胞總數。

同時，取 5 × 106細胞標記 FITC-CD11c 和PE-CD86，室溫放置 30 min；收集細胞后，用 PBS洗滌 2 次，上機檢測。計算 CD11c+CD86+DC 的比例和數量。

1.3 統計學處理

本研究采用 Prism5.0 進行統計分析，以±s進行描述。腫瘤生長曲線采用兩因素重復測量的方差分析，并結合t檢驗進行兩兩比較；其他數據采用方差分析，并結合t檢驗進行兩兩比較。以P＜ 0.05 表示差異具有統計學意義，P＜ 0.01 表示具有顯著性差異。

2 結果

2.1 Ad(E1-).sT 顯著抑制乳腺癌移植瘤的生長

在小鼠乳腺癌 4T1 移植瘤建立后，我們采用瘤內給藥方式給予重組腺病毒 Ad(E1-).Null 和Ad(E1-).sT 進行治療。通過監測腫瘤的體積，發現Ad(E1-).Null 對腫瘤生長無明顯抑制作用，而Ad(E1-).sT 則能夠有效抑制腫瘤的生長（圖 1A）。在治療終點（第 19 天），與 Ad(E1-).Null 相比，Ad(E1-).sT 治療可顯著抑制腫瘤重量的增加（圖1B）。

2.2 Ad(E1-).sT 治療動態調節小鼠外周血血象

Ad(E1-).sT 治療后，分別于第 12 天和第18 天監測小鼠外周血的血象。結果顯示，第12 天，Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 治療可促進淋巴細胞和中間細胞的增殖；第 18 天，淋巴細胞的數量開始回落，提示大量病毒已被機體清除；但是，粒細胞和中間細胞的比例則大幅上升。此外，與Ad(E1-).Null 相比，Ad(E1-).sT 治療可以顯著降低淋巴細胞和中間細胞的數量，并輕微下調粒細胞的數量（圖 2）。結果表明，Ad(E1-).sT 可通過調節淋巴細胞和炎癥細胞的增殖，抑制炎癥反應的過度激活，促進抗腫瘤免疫的形成。

圖 1 Ad(E1-).sT 抑制小鼠乳腺癌細胞 4T1 移植瘤的生長（A：腫瘤體積；B：腫瘤重量）Figure 1 Ad(E1-).sT inhibit the growth of mouse breast cancer xenograft (4T1) (A: Tumor volume; B: Tumor weight)

圖 2 Ad(E1-).sT 調節淋巴細胞和炎癥細胞的增殖（A：12 天；B：18 天）Figure 2 Ad(E1-).sT regulates the proliferation of lymphocytes and inflammatory cells (A: Day 12; B: Day 18)

2.3 Ad(E1-).sT 治療可促進小鼠外周血 CD4+T淋巴細胞的擴增

Ad(E1-).sT 治療后，于第 12 天分析了小鼠外周血中淋巴細胞的亞群。結果顯示，腫瘤細胞荷瘤，小鼠外周血中出現大量未成熟的 T 淋巴細胞（CD3+CD4-CD8-）。Ad(E1-).Null 和 Ad(E1-).sT 治療可以減少未成熟 T 淋巴細胞的比例，同時增加CD4+T 淋巴細胞和 CD8+T 淋巴細胞的比例。其中，Ad(E1-).sT 可促進 CD4+T 淋巴細胞的擴增，而且其調節作用強于 Ad(E1-).Null（圖 3）。上述結果表明，Ad(E1-).sT 可以通過促進 CD4+T 淋巴細胞的擴增，增強機體的抗腫瘤免疫反應。

2.4 Ad(E1-).sT 治療促進小鼠脾臟 DCs 的擴增與成熟

第 19 天，處死小鼠后，分離獲得了脾臟單細胞懸液，通過流式細胞術分析了 DCs 的比例與數量。結果顯示，Ad(E1-).Null 治療對脾臟 DCs 的比例和數量均無明顯的影響。Ad(E1-).sT 治療則可以有效提高 CD11c+CD86+的 DCs 細胞的比例，通過計數脾臟總細胞數，得到的 DCs 細胞總數也顯著提升（圖 4）。結合外周血中 T 淋巴細胞亞群的結果提示，Ad(E1-).sT 可能通過激活 CD4+T 淋巴細胞，進一步活化 DCs，從而形成特異性抗腫瘤免疫反應。

圖 3 第 12 天小鼠外周血 T 淋巴細胞亞群分析（A：CD4+T 淋巴細胞；B：CD8+T 淋巴細胞；C：CD4+ 與 CD8+T 淋巴細胞比例；*P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01）Figure 3 Analysis of subtypes of T lymphocytes in mouse peripheral blood on day 12 (A: CD4+T lymphocytes; B: CD8+T lymphocytes; C: Ratio of CD4+ to CD8+; *P ＜ 0.05；**P ＜ 0.01)

圖 4 Ad(E1-).sT 治療促進脾臟 DCs 的活化（A：DC 細胞含量；B：DC 細胞總數；*P ＜ 0.05）Figure 4 Ad(E1-).sT therapy promotes activation of DCs in spleen (A: Dendritic cells content; B: Total dendritic cells; *P ＜ 0.05)

3 討論

TGF-β 為多功能的細胞因子，在腫瘤的發生、發展過程中起著雙重作用：在腫瘤發生早期，TGF-β 可以通過 TGF-β/SMADs 信號通路抑制腫瘤的生長；而在腫瘤晚期，TGF-β 可通過多種途徑促進腫瘤的生長和轉移，例如，其可通過Scr/Fak/Akt 通路上調 VEGF 表達，促進血管生成；通過 PI3K/Akt/mTOR 通路上調缺氧誘導因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）表達等[9-10]。研究表明，在乳腺癌骨轉移灶中，Smad-2 磷酸化普遍存在，表明 TGF-β 信號被激活。而 TGF-β 可誘導溶骨相關因子和轉移相關分子的表達，如白細胞介素 11（interleukin-11，IL-11）、結締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、基質金屬蛋白酶-1（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）和甲狀旁腺激素相關蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）等；而 PTHrP 可進一步誘導 RANKL 的產生，促進破骨細胞分化，進而形成正反饋效應，促進骨轉移的發生和發展[11-13]。自腺病毒治療腫瘤的方法問世以來，因為它具有靶向性好、安全性高、感染能力強等多種優點，迅速成為腫瘤基因治療領域的熱點[14]。隨著研究的進一步深入，隨之出現了攜帶不同治療基因的重組腺病毒，它們既具備腺病毒的功能，同時又能夠發揮治療基因的作用，因此也具有更好的療效[15-16]。腺病毒是抗腫瘤治療中應用非常廣泛的基因載體，可以攜帶多種治療基因，治療基因導入腺病毒中可產生協同抗腫瘤的作用。2012 年，歐盟批準了西方國家第一個基因治療藥物 Glybera 上市，成為基因治療的重要里程碑[17]。經過 3 年的發展，美國食品藥品管理局（FDA）于 2015 年10 月批準了攜帶粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF）單純皰疹溶瘤病毒（HSV-1）上市[18]，為腫瘤基因治療注入了強心劑。影響腫瘤基因治療療效的關鍵因素，包括載體系統和治療基因。重組腺病毒載體具有易制備、高滴度產品、安全性強、宿主范圍廣、基因轉導效率高等優勢，在腫瘤基因治療的基礎和臨床研究中得到廣泛應用。本課題組前期研究發現，在乳腺癌及前列腺癌的骨轉移模型中，通過 sTGFβRIIFc 阻斷 TGF-β 信號，可抑制SMAD2 和 SMAD3 磷酸化，而溶瘤腺病毒聯合sTGFβRIIFc 則有效抑制腫瘤骨轉移的進展[4,19-20]。

作為多功能細胞因子，TGF-β 在誘導腫瘤微環境免疫耐受過程中發揮重要作用。研究表明，TGF-β可調節多種免疫細胞的活性，進而抑制抗腫瘤免疫反應的形成，主要包括：增強骨髓來源抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）在腫瘤局部的聚集；誘導 CD4+T 細胞向 CD4+Foxp3+調節性 T 細胞（regulatory T cells，Tregs）分化；下調自然殺傷細胞（natural killer cells，NK）和CD8+T 細胞表面 NKG2D 受體，減弱其細胞毒效應等[21-22]。進一步研究證實，阻斷 TGF-β 信號可抑制 MDSCs 和 CD4+Foxp3+Tregs，促進 NK 細胞和細胞毒性 T 淋巴細胞（cytotoxic T lymphocytes，CTLs）的活性，增強干擾素 γ（interferon γ，IFNγ）的表達及分泌，進而激活抗腫瘤免疫反應[23-25]。在前期研究中我們表明，攜帶 sTGFβRIIFc 的復制缺陷型腺病毒 Ad(E1-).sT 能夠抑制乳腺癌（MDA-MB-231）骨轉移的生長，但在免疫缺陷小鼠中無法評價其免疫激活效應[4,13]。因此，本課題建立了免疫完全的乳腺癌移植瘤模型，并對其免疫激活效應進行了評價，結果表明 Ad(E1-).sT 能抑制 4T1 移植瘤的生長；減輕病毒與腫瘤生長引起的炎癥反應；促進小鼠外周血 CD4+T 淋巴細胞的增殖和小鼠脾臟 DCs 的擴增。本研究完善了溶瘤腺病毒聯合 sTGFβRIIFc 治療骨轉移的作用機制，有助于推動其臨床應用。