鹽酸石蒜堿通過Akt/Smad 通路抑制肝星狀細胞增殖與活化

張鐿萱，葛茂旭，張娜，牛偉曉，鮑云洋，趙午莉，劉虹，邵榮光，何紅偉

慢性肝臟疾病是一類嚴重危害人類健康的疾病，其中肝纖維化是多種原因（如病毒感染、藥物誘導、自身免疫、膽汁淤積等代謝疾病）所引起的慢性肝病的共同病理學基礎，是形成肝硬化乃至肝癌的必經病理階段，其特征是肝星狀細胞（HSC）的大量增殖與活化，星狀細胞活化會大量分泌膠原、基質金屬蛋白酶、TGF-β 等肝纖維化相關蛋白，導致膠原為主的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）在肝內過度沉積[1]。隨著對肝纖維化機制研究的不斷深入，越來越多的研究證明肝纖維化具有可逆性[2]，這對于控制肝臟疾病惡性發展的防治有重要意義。

鹽酸石蒜堿（lycorine hydrochloride，LH）是石蒜科植物石蒜的鱗莖內的生物堿。近年來的研究證明，鹽酸石蒜堿具有抗炎、止痛、抗病毒、抗瘧疾、保護心血管、抗腫瘤等功效[3-5]，而其在肝纖維化領域中的研究未見報道。因此，本研究從探索鹽酸石蒜堿抗肝纖維化的活性出發，展開了相關的藥效和機制研究。

1 材料與方法

1.1 材料

細胞培養所需的 DMEM 培養基和胎牛血清購自美國 Gibco 公司；雙抗混合物（青霉素與鏈霉素）、轉染試劑 lipofectamine2000、Trizol 購自美國 Invitrogen 公司；G418 購自北京經科宏達生物技術有限公司；TGF-β1 購自美國 R & D 公司；人肝星狀細胞 LX2 為本實驗室培養；磺酰羅丹明 B（SRB）購自美國 Sigma 公司；Bright-GloTMLuciferase Assay System 購自美國 Promega 公司；Nucleo Spin RNA Clean-up 試劑盒購自德國Macherey-Nagel 公司；AffinityScript Multiple Temperature cDNA Synthesis Kit 購自美國 Agilent Technologies 公司；FastStart Universal Probe Master（Rox）購自瑞士 Roche 公司；Taqman 引物和探針購自美國 Applied Biosystem 公司；抗體GAPDH、p-Smad2、Smad2、Smad4、P-Akt、α-SMA購自美國 Cell Signaling Technology 公司；抗體collagen I、TGF-β1 購自美國 Abcam 公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術有限公司；化學發光HRP 底物購自美國 Millipore 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 實驗所用人肝星狀細胞系 LX2用含 10% FBS 和 1% 青霉素/鏈霉素的DMEM/GlutaMAXTM于 37 ℃、5% CO2的培養箱中培養。

熒光素酶報告基因系統檢測鹽酸石蒜堿的活性應用本實驗室構建的 I 型膠原 α1（COL1A1）啟動子-熒光素酶報告檢測系統[6]。將穩定轉染了pGL4.17-COL1A1P 的 LX2-COL 細胞接種于 96 孔板，培養 24 h 后以 1、10 和 100 μmol/L 不同濃度梯度給藥，24 h 后用熒光素酶試劑盒檢測熒光素酶活性。

1.2.2 體外細胞毒生物活性測定 SRB 蛋白比色法檢測化合物毒性和對細胞增殖的影響。LX2 細胞接于 96 孔板，不同濃度梯度給藥，24 h 后用 50%（W/V）TCA 按照 1∶4 的體積加入 96 孔板中進行固定過夜，清水洗凈后用 0.4%（W/V）SRB 染色 15 min，然后用 1% 乙酸漂洗，最后用非緩沖Tris-base 堿液（10 mmol/L，pH10.5）溶解，酶標儀測定 570 nm 處光密度值（OD）。根據藥物濃度和抑制率，利用 SigmaPlot10.0 軟件計算半數抑制濃度（IC50）。

1.2.3 實時熒光定量 LX2 細胞接于 6 孔板，匯合度接近 90% ～ 95% 時，用無血清培養基饑餓培養 24 h 后，給藥同時加 TGF-β1（2 ng/ml）誘導，24 h 后收集細胞。用 Trizol 提取總 RNA，用NucleoSpin RNA Clean-up 試劑盒純化，取 1 μg 樣品逆轉錄得到 cDNA，以 3 μl cDNA 為模板，0.5 μl Taqman 探針引物（MMP2 上游引物：CCTACACC AAGAACTTCCGTCTGT，下游引物：ATGTCAGGA GAGGCCCCATAG，探針：CAGGATGACATCAAG GGCATTCAGGAGC；COL1A1 上游引物：CCAGA AGAACTGGTACATCAGCAA，下游引物：CCGCC ATACTCGAACTGGAA，探針：CCCCAAGGACAA GAGGCATGTCTGGTT。GAPDH、TGF-β1 版權屬于美國 Applied Biosystem 公司，序列未公開），10 μl FastStart Universal Probe Master（Rox）和水配制成 20 μl 反應體系，進行實時熒光定量 PCR 儀檢測。

1.2.4 Western blot 檢測 收集經過 24 h 處理的LX2 細胞，用 PBS 沖洗 2 遍，加入 RIPA 裂解液，4 ℃ 裂解 30 min，12 000 ×g、4 ℃ 離心 20 min，收集上清液，BCA 法測定蛋白含量后等量分裝。SDS-PAGE 凝膠電泳將不同分子量的蛋白質分離，然后用濕轉法將膠上的蛋白質分子轉移到預處理后的 PVDF 膜上。在含 5% 脫脂奶粉的 PBST 中輕輕晃動封閉 1 h，4 ℃ 一抗孵育過夜后 PBST 洗膜 3 次后，將膜與合適稀釋濃度的二抗結合，室溫孵育 2 h 后 PBST 洗膜 3 次，加上 HRP 底物發光液，通過 FLUORchem HD2 凝膠成像系統進行曝光顯色。

1.3 統計學處理

每組實驗重復 3 次，實驗數據以±s形式表示，組間比較采用t檢驗，最終統計結果以P＜0.05 為有顯著性差異。

2 結果

2.1 單熒光素酶檢測藥物活性

COL1A1 的大量表達與過度沉積是肝纖維化的重要特征。本實驗室在前期的研究工作中構建了重組人 COL1A1 啟動子的熒光素酶報告質粒pGL4.17-hCOL1A1P，用來在體外篩選化合物的抗肝纖維化活性。實驗結果顯示，以 (-)-表沒食子兒茶素 沒 食子酸 酯 [(–)-epigallocatechin-3-gallate，EGCG]為陽性藥做對照，不同濃度的鹽酸石蒜堿（1、10 和 100 μmol/L）對 COL1A1 啟動子的活性抑制率分別為（15.2 ± 7.15）%、（46.22 ± 9.11）% 和（88.75 ± 5.62）%（圖 1）。

圖 1 LH 抑制 COL1A1 啟動子活性Figure 1 LH inhibited COL1A1 promoter activity

2.2 鹽酸石蒜堿抑制肝星狀細胞 LX2 的細胞增殖

為了在體外檢測鹽酸石蒜堿的抗肝纖維化活性，本研究首先利用 SRB 比色法檢測了鹽酸石蒜堿的毒性和對體外培養 LX2 細胞增殖的影響，以確定鹽酸石蒜堿體外作用的有效濃度范圍。實驗結果顯示，不同濃度的鹽酸石蒜堿（0.3、1、3、10、30 和 100 μmol/L）作用 24 h 后，LX2 細胞的存活率分別為（93.43 ± 1.90）%、（75.91 ± 3.68）%、（66.68 ± 1.07）%、（52.20 ± 3.03）%、（32.48 ±0.57）%、（18.33 ± 3.23）%（圖 2），即鹽酸石蒜堿能劑量依賴性地抑制 LX2 細胞的增殖。鹽酸石蒜堿對 LX2 細胞作用的 IC50值為（9.79 ±1.02）μmol/L。

2.3 鹽酸石蒜堿抑制肝星狀細胞 LX2 的活化

除了考察鹽酸石蒜堿對肝星狀細胞 LX2 的增殖抑制作用以外，我們還采用 TGF-β1 誘導 LX2細胞活化的同時進行加藥處理，通過 qRT-PCR 和Western blot 檢測肝纖維化相關基因 TGF-β1、COL1A1 和金屬機制蛋白酶 2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）mRNA 的變化以及TGF-β1、α-SMA、MMP2 和 COL1A1 蛋白的變化，從而評價其對 LX2 細胞活化的抑制效果。結果顯示，TGF-β1 誘導后經過不同濃度鹽酸石蒜堿處理，可以顯著下調 TGF-β1、MMP2、α-SMA、COL1A1 mRNA 水平（圖 3A）和（或）蛋白水平（圖 3B）的表達，并呈現劑量依賴性。結果表明，鹽酸石蒜堿具有良好的體外抑制肝纖維化的作用。

2.4 鹽酸石蒜堿抑制 Akt/Smad 信號通路活性

TGF-β 主要通過經典的 Smad 依賴的途徑（即 TGF-β/Smad 信號通路）調控肝纖維化的發生發展[7-8]。Smad 蛋白是 TGF-β 信號傳入 HSC 細胞核的關鍵蛋白，研究發現，Smad2 的過度表達與纖維結合蛋白和 I 型膠原沉積的增加密切相關[9]，有研究證明 TGF-β 受體還可以通過磷酸化或與信號中間體結合激活包括磷脂酰肌醇激酶 PI3K/Akt等信號通路[10]，本實驗室先前的研究也證明了 Akt可以影響 TGF-β/Smad 信號通路的激活[11]。在前期研究中，我們發現鹽酸石蒜堿可以顯著地抑制肝纖維化標志性蛋白 COL1A1 的表達。而 COL1A1的表達可被 TGF-β 信號通路調控。因此檢測了鹽酸石蒜堿對 TGF-β 誘導后 Akt/Smad 信號通路的影響。Western blot 結果顯示，TGF-β1 誘導后，Akt 和 Smad2 途徑的磷酸化水平顯著升高，而在 TGF-β1 誘導的同時給予鹽酸石蒜堿，Akt和 Smad2 磷酸化水平降低，且與藥物濃度正相關（圖 4）。由此我們認為鹽酸石蒜堿可能通過抑制Akt/Smad 途徑的磷酸化水平發揮其抗肝纖維化的作用。

圖 2 LH 抑制 LX2 細胞增殖Figure 2 LH decreased the survival of hepatic stellate cell LX2

圖 3 LH 顯著降低 LX2 細胞中纖維化標志基因（A）和蛋白質的表達（B）Figure 3 LH significantly reduced the expression of fibrotic marker gene (A) and proteins in human HSC line LX2 (B)

3 討論

我國是一個肝病高發國家，除 HBV、HCV 高感染率外，酒精肝、脂肪肝和藥物性肝等的發病率也逐年上升。慢性肝病已經給家庭和社會造成了嚴重的影響，亟需開發出能用于臨床的高效且無明顯毒副作用的抗肝纖維化的藥物。肝星狀細胞是肝纖維化的細胞學基礎。

石蒜堿是一種從石蒜科植物中提取的生物堿，因其具有明顯的生長抑制能力，如誘導細胞凋亡[12-14]和細胞周期阻滯[15-17]和抑制血管生成[4]，被認為是一種潛在的抗癌藥物[18]，對前列腺癌[12]、多發性骨髓瘤[15]、卵巢癌[16]、肺上皮癌[19]、白血病[13-14,17]和黑素瘤[4,20]均有明顯抑制作用。而鹽酸石蒜堿在抗肝纖維化的研究中尚未見報道，本研究通過實驗室已有的肝纖維化篩選模型篩選發現，鹽酸石蒜堿具備抗肝纖維化的活性。

肝星狀細胞是肝纖維化的細胞學基礎，其激活后會大量增殖，同時分泌大量細胞因子、膠原、基質金屬蛋白酶等肝纖維化相關的蛋白。在本研究中，通過 SRB 法檢測發現，LH 有明顯抑制肝星狀細胞增殖的活性。

在肝纖維化中，TGF-β/Smad 和 PI3K/Akt 兩條信號通路至關重要，并且有一定交叉調控作用。Akt 可以通過促進 Smad2/3 的磷酸化及其向細胞核內轉移來增強 TGF-β/Smad 信號通路的調控作用，從而促進細胞增殖，膠原沉積和 α-SMA 的表達[21]。同時，TGF-β 可以快速激活 PI3K/Akt 的磷酸化，隨后影響其下游靶標的磷酸化來促進細胞生長和存活，這種激活似乎與 Smad2/3 激活無關。本實驗室通過使用 PI3K 抑制劑 LY294002 證明了 PI3K/Akt/Smad 信號通路在肝纖維化中發揮的作用[11]。本研究同樣證明了 LH 可以通過抑制 Akt蛋白表達來降低 Smad2 的磷酸化水平，削弱了TGF-β/Smad 信號通路的影響，即通過 Akt/Smad信號通路發揮抗肝纖維化作用。研究證明了鹽酸石蒜堿不僅能抑制肝星狀細胞的增殖，還能夠抑制其活化，這種作用是通過抑制 Akt/Smad 通路活性實現的。這些結果提示鹽酸石蒜堿有較好的抗肝纖維化活性，有成為潛在治療肝纖維化藥物的可能。