凝血因子X 激活劑效價測定方法的建立及驗證

崔亮亮，李秀琳，李秀娜，丁忠福，石皎，孫東，薛雁

作者單位：110171 沈陽，遼寧遠大諾康生物制藥有限公司

蛇毒中含有多種能夠影響哺乳動物凝血系統的酶類，這些酶類與凝血機制級聯放大反應中的各個凝血因子之間有比較嚴格的專一性作用，其中凝血因子 X 激活劑（coagulation factor X activator，FXA）是一種能夠直接作用于凝血因子 X（coagulation factor X，FX）的具有蛋白水解酶特性的酶類，在蝰亞科、蝮亞科、眼鏡蛇科等蛇毒中分布廣泛[1]。人體正常的血液系統處于促凝-抗凝之間的動態平衡，當機體受到外源傷害或疾病干擾時，機體的凝血平衡被打破，啟動凝血瀑布級聯放大反應以抵抗外來因素的影響。然而無論是外源凝血途徑還是內源凝血途徑，最終均是凝血因子 FX 被激活為活化狀態，即活化的凝血因子 X（coagulation factor X activated，FXa），FXa 激活凝血酶原生成凝血酶，發揮凝血作用[2]。巴西矛頭蝮蛇蛇毒中分離得到的凝血因子 X 激活劑，為分子量 80000 D 左右的單一組分的糖蛋白，含有一條重鏈和兩條輕鏈，具有鈣離子依賴性。體外研究表明，在 Ca2+存在的條件下 FXA 可以特異性地水解 FX 生成 FXa，近而使人-枸櫞酸血漿凝固[3-4]。體內試驗研究表明，FXA 可明顯縮短正常小鼠的斷尾出血時間，具有較好的止血作用，鑒于 FXA 高度特異性作用特點，初步判斷對 A 型血友病小鼠也會有較好的止血效果[5]，可緩解目前臨床僅靠補充凝血因子 VIII 治療 A 型血友病的局面，降低患者的經濟負擔，具有較好的藥物經濟學價值。

目前，根據作用底物的不同可將 FXA 的活性測定方法分為兩大類：第一大類為天然底物法，即以人血漿為底物，以 FXA 加入血漿發生凝固的時間來進行 FXA 的活性測定。該法在 20 世紀 80 年代初得到普遍應用，方法常規[6]。第二大類為生色底物法，即通過 FXa 水解生色底物產生有特征吸收的生色產物進行的活性測定，又可分為二步法和FXA 外標法。二步法即在 FXA 作用于 FX 一段時間后加入終止劑，同時加入生色底物，根據特定時間內 FXa 的生成量計算 FXA 的活性[7]。FXA 外標法，通過檢測 FXA 標準品不同濃度在 405 nm 處對硝基苯胺（pNA）的吸光度，繪制標準曲線計算待測樣品效價。我們建立的方法是以 FX為反應底物，FXA 激活 FX 生成 FXa，FXa 水解生色底物生成在 405 nm 波長有最大吸收顯黃色的對硝基苯胺，在FX 和生色底物足量的條件下，對硝基苯胺濃度僅與 FXA的活性相關且在一定的范圍內具有線性相關性，依據 1 min內生成對硝基苯胺的物質的量計算 FXA 的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器 人源凝血因子 X 購自美國 Merck公司，批號：D00175389，1.4 mg/ml，119.4 U/mg；人凝血因子 X 購自 Hyphen BioMed 公司，批號：141104B，8 U/瓶；生色底物 S-2765（N-α-Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl，批號：N1143454，25 mg；Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA·2HCl，批號：150410，10 mg）分別購自 Cheromogenix 和 Aglyco 公司；FXA 溶液購自遼寧遠大諾康生物制藥有限公司，批號：150107、150203、150406；Tris、HCl、CaCl2、EDTA、苯甲脒為國產分析純。Evolvtion220 和 Lambda 35 型溫控紫外分光光度儀分別購自 Thermo 和 Perkin Elmer 公司。

1.1.2 試劑配制 緩沖溶液 1：稱取 Tris 1.210 g、NaCl 1.755 g、苯甲脒 0.031 g、CaCl20.111 g 溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液調 pH 到 7.5，定容至 100 ml。緩沖溶液 2：稱取 Tris 12.1 g、NaCl 4.387 g、EDTA 1.861 g、溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液調 pH 到8.3，定容至 100 ml。緩沖溶液 3：稱取 Tris 0.242 g、NaCl 0.585 g、苯甲脒 0.01557 g、溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L的 HCl 溶液調 pH 到 7.4，定容至 100 ml。稀釋液：稱取Tris 0.121 g，溶于 80 ml 蒸餾水中，用 2 mol/L 的 HCl 溶液調 pH 8.0，定容至 100 ml。生色底物 S-2765 溶液：用蒸餾水溶解，稀釋至 1.5 mg/ml。FX 溶液：用緩沖溶液 3 將FX 溶液稀釋至 1.25 U/ml。取 FXA 溶液，用稀釋液稀釋至適當濃度，作為供試品。

1.2 方法

1.2.1 實驗過程 取供試品溶液、緩沖液 1、FX 溶液各200 μl 加至比色皿混勻，37 ℃ 溫控紫外分光光度儀中保溫 10 min，立即加入 200 μl 緩沖液 2、200 μl S-2765 溶液，混勻，37 ℃ 條件下，在 405 nm 處測定 0、1、2、3 min的吸收值A0、A1、A2、A3，A3–A0= ΔA，以供試品稀釋液作為空白對照。供試品進行適量稀釋，使測試的對硝基苯胺濃度為 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min)，即 C 值為 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min)。由公式計算 FXA 效價，重復測定 3 次，取平均值[8]。

t：測定時間（min）；Vt：反應總體積（ml）；10.4：對硝基苯胺摩爾吸光系數[ml/(μmol·cm)]；1：光程（cm）；Vs：FXA 供試品體積（ml）；n：FXA 供試品稀釋倍數；ΔA=A3–A0。

1.2.2 FXA 單位定義 37 ℃，pH 8.0 條件下，1 min 內生成 1 μmol 對硝基苯胺需要的酶量定義為 1 單位的FXA[9]。

1.2.3 方法驗證

1.2.3.1 范圍 測定不同濃度的 FXA，確定對硝基苯胺濃度的可測量范圍。

1.2.3.2 重復性 在測量范圍內，重復 6 次測定同一批次FXA 活性。

1.2.3.3 中間精密度 在測量范圍內，不同人員不同日期測定同一批次 FXA 活性。

1.2.3.4 耐用性 在測量范圍內，分別采用不同廠家反應底物凝血因子 X（FX）、不同廠家生色底物（S-2765）、不同廠家紫外分光光度儀測定同一批次 FXA 活性。

1.2.3.5 回收率（準確性） 在測量范圍內，測定供試品FXA 不同濃度的吸收值，制作標準曲線。計算曲線線性及理論效價，實測效價與理論效價比值為回收率。

1.2.3.6 穩定性 在測量范圍內，測定 3 批次 FXA 活性，計算比活力。

表 1 FXA 測量范圍確定結果

圖 1 供試品稀釋倍數的倒數與對硝基苯胺濃度的線性關系

表 2 重復性試驗結果

表 3 精密度結果

2 結果

2.1 范圍考察

供試品 150107 選擇 6 個稀釋倍數進行檢測，對硝基苯胺的濃度范圍確定結果如表 1 所示，近而限定 FXA 的最佳工作濃度范圍。以供試品稀釋倍數的倒數為橫坐標，對硝基苯胺濃度為縱坐標，繪制曲線，結果見圖 1。

由表 1 數據可以得出，將 FXA 稀釋適宜濃度使生成的對硝基苯胺濃度在 0.042 ～ 0.274 μmol/(ml·min) 范圍內，FXA 的效價穩定。范圍線性方程為 y = 856.61x + 0.00162，r2= 0.99118，供試品稀釋倍數的倒數與對硝基苯胺濃度線性關系良好。考慮 FXA 供試品稀釋的適宜性，確定使生成的對硝基苯胺濃度在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內。

2.2 重復性

取供試品 150107 適宜稀釋，使對硝基苯胺濃度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，重復稀釋測試 6 次，150107 的效價平均值為 875 U/ml，重復性 RSD 為 2.1%，結果見表 2。

2.3 中間精密度

取供試品 150107 適宜稀釋，使對硝基苯胺濃度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，不同人員不同時間進行測試，結果見表 3。150107 的效價平均值為 906 U/ml，精密度 RSD 為 2.8%。

2.4 耐用性

2.4.1 不同廠家 FX 測定 FXA 效價穩定性 取供試品 150107 適宜稀釋，使對硝基苯胺濃度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，用不同廠家反應底物 FX 測定，結果見表 4。不同廠家的 FX 測試供試品效價分別為869 U/ml 和 771 U/ml，RSD 為 6.8%。

2.4.2 不同廠家 S-2765 測定 FXA 效價穩定性 取供試品 150107 適宜稀釋，使對硝基苯胺濃度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，用不同廠家生色底物 S-2765測定效價，結果見表 5。不同廠家的 S-2765 測試供試品效價分別為 876 U/ml 和 860 U/ml，RSD 為 2.2%。

表 4 不同廠家 FX 測定結果

表 5 不同廠家 S-2765 測定結果

表 6 不同設備測定結果

表 7 線性及回收率結果

圖 2 對硝基苯胺的線性曲線

表 8 3 批 FXA 的測定結果

2.4.3 不同型號儀器測定 FXA 效價穩定性 取供試品 150107 適宜稀釋，使對硝基苯胺濃度在 0.1 ～0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，用不同型號紫外分光光度計測定效價，結果見表 6。不同型號的儀器測試供試品效價分別為 869 和 897 U/ml，RSD 為 2.6%。

2.5 回收率

取供試品 150107 適宜稀釋，使對硝基苯胺濃度在0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，分別稀釋 8333 倍、7143 倍、6250 倍、5000 倍、4000 倍，結果如表 7。以供試品稀釋倍數的倒數為橫坐標，對硝基苯胺濃度為縱坐標繪制曲線，結果見圖 2。線性方程為 y = 848.13x + 0.001282，r2= 0.99356。將稀釋倍數倒數帶入標準曲線，計算理論效價，實測效價與理論效價比值為回收率，回收率平均值為100.2%，RSD 為 2.6%。

2.6 3 批 FXA 效價測定

取供試品 150107、150203、150406 分別適宜稀釋，使對硝基苯胺濃度在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，測定效價，結果見表 8。3 批供試品比活力均在 5500 U/mg左右。

3 討論

3.1 溫控紫外分光光度儀測定 FXA 效價方法的反應機制

FXA 水解 FX 生成 FXa，FXa 水解生色底物（S-2765）生成游離對硝基苯胺，呈黃色，在 λ = 405 nm 下有最大吸收。如果底物濃度足夠大，能夠使酶的活性中心全部飽和，則反應速度與底物濃度無關，而與酶活性中心的濃度成正比，在 FX 與 S-2765 均足量的條件下，對硝基苯胺的生成量與 FXA 的含量成正相關。37 ℃ 條件下，1 min 內生成 1 μmol 對硝基苯胺所需的酶量定義為 1 單位的 FXA。

3.2 溫控紫外分光光度儀測定 FXA 效價方法的特點

20 世紀 80 年代初普遍應用的天然底物法以血漿為底物，需目測判斷血漿凝固時間，受檢測者主觀干擾，并且不同廠家的人質控血漿和普通人枸櫞酸血漿 FX 含量差異較大，從而導致 FXA 效價測試結果不一致。因此，近二十年文獻多采用更加靈敏、可靠、穩定的生色底物法對 FXA進行檢測[10]，生色底物法又分為二步法和 FXA 外標法。二步法需要引入 FXa 標準品，不能排除在活化的早期階段和FXa 生成量之間可能存在的非線性關系，因而不能精確地反映 FXA 的活性作用特點[11]。FXA 外標法需提供 FXA標準品，而 FXA 標準品又以血漿為底物目測方法標定，同樣會出現測試結果不穩定的問題。

本方法不用 FXA 和 FXa 標準品間接計算待測品效價，用單位時間內對硝基苯胺生成量定義 FXA 活性單位，減少測試過程中誤差。在 0.1 ～ 0.2 μmol/(ml·min) 的范圍內，供試品稀釋倍數的倒數與對硝基苯胺濃度線性關系良好（r2≥ 0.99），從而驗證方法中選擇的反應底物 FX 濃度足量。檢測過程中記錄 0、1、2、3 min 的吸收值（405 nm），從而可驗證反應中生色底物 S-2765 是否足量。在線性范圍和 3 min 內滿足底物 FX 和 S-2765 均過量條件下，該方法具有較好的線性、重復性、精密度和耐用性，能夠準確、穩定、方便地測定 FXA 的效價。