轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測技術(shù)研究進(jìn)展

◎ 汪 新

（浙江方圓檢測集團(tuán)股份有限公司，浙江 杭州 310018）

隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，大量的轉(zhuǎn)基因食物出現(xiàn)在人們的生活之中，因此應(yīng)當(dāng)有效促進(jìn)轉(zhuǎn)基因食品檢測技術(shù)的有效提升。在國際上建立一定的轉(zhuǎn)基因食品標(biāo)志監(jiān)督體系，這也是在國際貿(mào)易中突破技術(shù)性壁壘的重要發(fā)展方式。目前采用的對于轉(zhuǎn)基因成分的檢測方式主要有蛋白質(zhì)水平的檢測、核酸水平的檢測以及將兩者聯(lián)合進(jìn)行檢測。

1　蛋白質(zhì)水平的檢測技術(shù)

酶聯(lián)免疫吸附法（EnzymeLinked Immunosorbent Assay，ELISA）是以抗原、抗體為基礎(chǔ)的免疫學(xué)方法，通過特異性檢測外源蛋白來定性或定量檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。該方法借助于酶標(biāo)儀可根據(jù)已知標(biāo)注物質(zhì)的一系列濃度梯度與吸光度值來制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此確定樣品中轉(zhuǎn)基因蛋白的含量，但只能達(dá)到半定量檢測的水平。

Roland等早在1992年就將ELISA技術(shù)用于轉(zhuǎn)基因植物中nptⅡ基因表達(dá)產(chǎn)物的定量分析，以抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆為材料，建立了檢測表達(dá)CP4EP-SPS蛋白的ELISA定量方法。Kim等采用ELISA檢測技術(shù)對轉(zhuǎn)基因胡椒中外源基因不同時間表達(dá)效率進(jìn)行了定量比較研究。針對轉(zhuǎn)基因棉花Bt基因表達(dá)蛋白和nptⅡ基因表達(dá)蛋白能夠建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附定量檢測方法。

ELISA法具備酶反應(yīng)的高靈敏度和抗原抗體反應(yīng)的特異性，同時還可以與PCR相結(jié)合，將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，再與抗體特異性結(jié)合，并使底物顯色，可以根據(jù)吸光值的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行半定量分析，具有操作簡單，費(fèi)用低、特異性好，可實(shí)現(xiàn)高通量檢測的優(yōu)點(diǎn)。但ELISA法本身易出現(xiàn)本底過高，以及如保溫時間的差異、洗滌方法不同等相關(guān)因素都有可能導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差，在實(shí)際操作中只能檢測有限種類未加工的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品。

2　核酸水平上的檢測技術(shù)

目前，轉(zhuǎn)基因食品技術(shù)已經(jīng)比較成熟，在世界各地中轉(zhuǎn)基因食物已經(jīng)具有了非常廣泛的應(yīng)用價(jià)值與應(yīng)用空間，為了加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因食物的有效食用，應(yīng)有效地提升加強(qiáng)轉(zhuǎn)基因食物檢測安全性。目前核酸水平上的檢測技術(shù)主要包括多重PCR檢測技術(shù)、巢式PCR檢測技術(shù)與定量PCR檢測技術(shù)，本文從這3個方面進(jìn)行了相應(yīng)分析。

2.1　多重PCR檢測技術(shù)

多重PCR的運(yùn)用在普通的PCR體系中加入兩對或者量對以上的特異性引物，通過一次反應(yīng)的發(fā)生有效擴(kuò)增多個基因片段，比較快速高效，具有很強(qiáng)的經(jīng)濟(jì)性，由于擴(kuò)增過程中競爭性的存在，使得假陽性出現(xiàn)的概率較低。在基因甜米酒的檢測過程中能夠達(dá)到比較良好的特異性[2]。

2.2　巢式PCR檢測技術(shù)

巢式PCR檢測技術(shù)是對同一個基因目標(biāo)設(shè)計(jì)兩對引物，其中第二對引物能夠?qū)崿F(xiàn)在第一對引物增產(chǎn)的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)二次擴(kuò)增，同時這兩條引物在退火的溫度上能夠?qū)崿F(xiàn)互相獨(dú)立運(yùn)行，不會產(chǎn)生干擾，通過兩輪PCR擴(kuò)增方式最終實(shí)現(xiàn)了對某一基因進(jìn)行檢測的目的。采用半巢式PCR檢測技術(shù)與巢式PCR檢測的原理相同，只是具有一對半引物，運(yùn)行中只有一條引物被用來當(dāng)作第二輪的PCR擴(kuò)增反應(yīng)。如此采用巢式與半巢式PCR檢測技術(shù)能夠通過檢測特異性的提升加強(qiáng)靈敏度與擴(kuò)增效率的有效提升，在深加工產(chǎn)品的轉(zhuǎn)基因定性分析中具有重要的應(yīng)用價(jià)值與空間[3]。

2.3　定量PCR檢測技術(shù)

定量PCR檢測技術(shù)中，應(yīng)用較多的是實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，在普通PCR反應(yīng)中加上熒光基因，這種熒光信號能夠?qū)崿F(xiàn)隨著PCR反應(yīng)的變化而出現(xiàn)相應(yīng)的變化，一直到反應(yīng)的平臺期即n。在這一過程中可以使用計(jì)算機(jī)充分記錄熒光信號的變化情況，通過比較標(biāo)準(zhǔn)曲線的方式，定量分析被檢測樣品中的特定成分。由于添加的熒光基因的不同，實(shí)時熒光定量PCR分析法可以分為TaqMan探針法與DNA結(jié)合染料法即SYBR Green染料法[4]。

3　聯(lián)合檢測技術(shù)

不同的檢測技術(shù)具有其相應(yīng)的優(yōu)缺點(diǎn)，在使用過程中將兩者進(jìn)行結(jié)合是最有效的檢測方式。通過將PCR技術(shù)與ELISA技術(shù)相結(jié)合，能夠有效避免有毒物質(zhì)EB的使用，實(shí)現(xiàn)雜交檢測的自動化發(fā)展，對于儀器的要求比較低，實(shí)行起來比較容易操作。通過對NOS終止子、Bar基因、CaMV35S啟動子、Gus以及篩選標(biāo)記基因hpt進(jìn)行聯(lián)合檢測體系的建立，能夠?qū)崿F(xiàn)對于轉(zhuǎn)基因大米0.1%檢測靈敏性的達(dá)成，并且在一天之內(nèi)就可以完成，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。將兩者進(jìn)行聯(lián)合運(yùn)用符合目前轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測的趨勢發(fā)展。

4　結(jié)語

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展為外源基因的培育提供了有效的發(fā)展途徑，但是轉(zhuǎn)基因食品在研究、生產(chǎn)與銷售環(huán)節(jié)上存在著各種擴(kuò)散與污染隱患，在發(fā)展過程中應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視，加強(qiáng)對轉(zhuǎn)基因食品商品化的管理，采用有效的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品成分檢測，從而實(shí)現(xiàn)對轉(zhuǎn)基因食物進(jìn)行統(tǒng)一安全地檢測。