神經(jīng)調(diào)節(jié)因子1對(duì)老年C57BL/6J小鼠聽(tīng)皮層的保護(hù)作用

楊振棟 張?jiān)泼?于亞峰

蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科（江蘇蘇州 215006）

衰老是人類不可避免的自然現(xiàn)象。隨著年齡的增長(zhǎng)，各個(gè)器官都會(huì)經(jīng)歷退變的過(guò)程。年齡相關(guān)性聽(tīng)力下降又稱老年性聾，它的病因相當(dāng)復(fù)雜，不僅與年齡相關(guān)，而且與遺傳、環(huán)境、社會(huì)等因素密切相關(guān)，是個(gè)多因素疾病。毛細(xì)胞的減少和螺旋神經(jīng)元的退變被認(rèn)為是周?chē)?tīng)覺(jué)系統(tǒng)退變的主要因素［1］。近年來(lái)，中樞聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的退變也被認(rèn)為伴隨著周?chē)?tīng)覺(jué)系統(tǒng)退變從而參與了老年性聾的病理過(guò)程［2］，導(dǎo)致其噪聲環(huán)境下言語(yǔ)理解能力及處理能力的下降。聽(tīng)皮層作為聽(tīng)覺(jué)中樞的高層，隨著年齡的增長(zhǎng)同樣也出現(xiàn)了退變［3］。如何延緩老年性聾一直是個(gè)難題，聽(tīng)覺(jué)中樞神經(jīng)元的再生還遙不可及。

神經(jīng)調(diào)節(jié)因子（neuregulins，NRGs）作為信號(hào)蛋白，介導(dǎo)神經(jīng)系統(tǒng)、心臟、乳腺和其他器官系統(tǒng)細(xì)胞和細(xì)胞之間的聯(lián)系。NRG1是其中一種，屬于表皮生長(zhǎng)因子家族成員。有研究表明NRG1?ErbB信號(hào)通路在內(nèi)耳的發(fā)育和成長(zhǎng)過(guò)程中起著顯著的作用，NRG1能夠促進(jìn)I型螺旋神經(jīng)元的存活［4］。那么，NRG1對(duì)聽(tīng)皮層神經(jīng)元有無(wú)保護(hù)作用?本課題組選取老年C57BL/6J小鼠作為觀察對(duì)象，研究NRG1對(duì)其聽(tīng)皮層是否有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料取6～8周、42～44周的雄性小鼠分為兩組，每組10只，頸椎脫臼處死后，迅速取出雙側(cè)聽(tīng)皮層并放置于液氮中，采用RTPCR的方法檢測(cè)了兩組聽(tīng)皮層NRG1的表達(dá)情況。取30只42～44周C57BL/6J雄性小鼠，按使用藥物的不同分為NRG1組、m?NGF組和生理鹽水組，分別給予NRG1 0.1 mg/mL，鼠神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（mouse neurotrophic factor，m?NGF）9 μg/mL以及生理鹽水，每組10只，采用腹腔注射的方法連續(xù)給藥8周，注射劑量均為0.1 mL/d。動(dòng)物經(jīng)頸椎脫臼處死后，迅速取出聽(tīng)皮層并放置于2%的戊二醛中固定，行透射電鏡觀察聽(tīng)皮層神經(jīng)元等超微結(jié)構(gòu)。另取標(biāo)本放置于4%的多聚甲醛中固定，行免疫組化觀察NRG1的表達(dá)變化。NRG1購(gòu)自于美國(guó)的R&D systems。m?NGF購(gòu)自于廈門(mén)北大之路生物工程有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物購(gòu)自于蘇州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，耳廓反射均可以引出。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR檢測(cè)RNA的提取按Trizol法（Invitrogen，美國(guó)）進(jìn)行，確定RNA濃度后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。反應(yīng)體系：5×Prime?Script Buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、oligo（dT）1 μL、Random 6 mers 1 μL、Total RNA 13 μL，總體系20 μL。反應(yīng)條件：37 ℃，1 h；85℃，5 min。將制備好的cDNA和定量梯度陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系如下：2×Super?Real PreMix Plus 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 8 μL，總體系20 μL。PCR擴(kuò)增條件：首先50℃作用3 min，接著95℃作用15 min，95℃作用10 s，55 ℃作用20 s，72 ℃ 作用30 s，接著40個(gè)循環(huán)95℃變性10 s。溶解曲線：從70℃到95℃，每增加0.5℃作用5 s。各引物序列為AC?TIN：上游 5′?GTGACGTTGACATCCGTAAAGA?3′，下游 5′?GCCGGACTCATCGTACTCC?3′；NRG1：上游 5′?TTCCCATTCTGGCTTGTCTAGT?3′，下游 5′?CCAGGGTCAAGGTGGGTAG?3′。

1.2.2 透射電鏡取出的聽(tīng)皮層組織塊切1 mm3的大小。在2%戊二醛4℃下固定2 h，PBS緩沖液漂洗后1%鋨酸4℃下固定2 h，PBS緩沖液漂洗。梯度乙醇逐級(jí)脫水。環(huán)氧丙烷置換。環(huán)氧樹(shù)脂618包埋液與環(huán)氧丙烷（1∶1）浸透2 h，環(huán)氧樹(shù)脂618包埋液與環(huán)氧丙烷（2∶1）過(guò)夜，純環(huán)氧樹(shù)脂618包埋液浸透37℃6 h。包埋，切片。枸椽酸鉛電子染色。透射電鏡下觀察。

1.2.3 免疫組化取出的聽(tīng)皮層組織浸入4%的多聚甲醛固定液中過(guò)夜。固定好的組織行石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm。石蠟切片常規(guī)脫蠟和水化，用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。切片在37℃下浸入1%BSA溶液（含0.3%triton?x?100）中封閉30 min。隨后入一抗：（NRG1 1∶100）。陰性對(duì)照組采用PBS緩沖液代替一抗。置4℃冰箱中過(guò)夜，隔1 d用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min后再入相關(guān)生物素化的二抗30 min（1∶200），用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min，然后浸入ABC溶液2 h，再用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。接著使用DAB顯色15 min后鏡下觀察中止反應(yīng)，復(fù)染使用蘇木精。0.01 mmol/L PBS清洗終止反應(yīng)后，用中性樹(shù)膠封片后即可于鏡下觀察。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)采用正態(tài)分布檢驗(yàn)、方差齊性檢驗(yàn)，組間的均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，所有統(tǒng)計(jì)資料以P＜0.05來(lái)表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR結(jié)果以ACTIN的表達(dá)量作為參照標(biāo)準(zhǔn)來(lái)計(jì)算兩組聽(tīng)皮層上的NRG1 mRNA的 ΔCt以及 ΔΔCt，最后通過(guò)計(jì)算公式2?ΔΔCT來(lái)分別計(jì)算各基因的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠聽(tīng)皮層上的表達(dá)（0.203 0±0.008 6）明顯少于6～8周（0.533 3±0.313 0），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 透射電鏡觀察結(jié)果生理鹽水組脫髓鞘改變明顯（圖1A）。NRG1髓鞘扭曲情況較生理鹽水組改善（圖1B）。m?NGF組髓鞘較NRG1組有輕度脫髓鞘改變（圖1C）。

2.3 免疫組化結(jié)果聽(tīng)皮層上免疫反應(yīng)產(chǎn)物陽(yáng)性物質(zhì)為棕黃色顆粒，其表達(dá)量使用IPP 6.0軟件所測(cè)得的平均光密度來(lái)表示（表1）。NRG1組NRG1的表達(dá)高于其他兩組（圖2A），而m?NGF組NRG1的表達(dá)（圖2B）高于生理鹽水組（圖2C）。

圖1 使用神經(jīng)調(diào)節(jié)因子后42～44周小鼠聽(tīng)皮層超微結(jié)構(gòu)的透射電鏡觀察結(jié)果Fig.1 Ultrastructure of the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment observed by transmission electron microscopy

表1 3組NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠聽(tīng)皮層上的表達(dá)Tab.1 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice

3 討論

臨床上老年性聾分為中樞性、周?chē)院突旌闲?種，以混合性居多，即老年性聾患者同時(shí)有外周聽(tīng)力障礙及中樞聽(tīng)覺(jué)處理障礙。一般來(lái)說(shuō)老年性聾分為4類，即感音性、神經(jīng)性、代謝性和機(jī)械性耳聾。后來(lái)又補(bǔ)充了中樞型老年性聾，即聽(tīng)覺(jué)各級(jí)中樞呈現(xiàn)退行性變，這是導(dǎo)致老年人言語(yǔ)交往障礙的主要原因。這種現(xiàn)象又被稱作中樞聽(tīng)覺(jué)功能障礙。

圖2 使用神經(jīng)調(diào)節(jié)因子后42～44周小鼠聽(tīng)皮層NRG1的表達(dá)變化Fig.2 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment assessed with immunohistochemistry

NRG1主要表達(dá)在中樞的突觸區(qū)域，與突觸的傳遞密切相關(guān)［5］。廣泛的研究已經(jīng)表明NRG1通過(guò)正向和負(fù)向信號(hào)通路在突觸傳遞中起了關(guān)鍵的作用［6］。NRG1的正向信號(hào)通路通過(guò)把細(xì)胞外的區(qū)域與ErbB受體結(jié)合，能夠調(diào)節(jié)突觸相關(guān)蛋白例如神經(jīng)遞質(zhì)和離子通道的表達(dá)［7］。NRG1負(fù)向信號(hào)通路通過(guò)細(xì)胞質(zhì)區(qū)域的核易位能上調(diào)凋亡和突觸基因的表達(dá)［8］。

NRG1的中樞神經(jīng)保護(hù)作用已經(jīng)被國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)多次報(bào)道，比如在帕金森病，NRG1能夠保護(hù)受損的多巴胺能神經(jīng)元，能減少神經(jīng)元的凋亡［9］。那么NRG1對(duì)老年鼠聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)的神經(jīng)元和突觸有無(wú)保護(hù)作用呢？有報(bào)道［10］NRG1在耳蝸和螺旋神經(jīng)元上皆有顯著的表達(dá)。近來(lái)有實(shí)驗(yàn)指出轉(zhuǎn)有NRG1基因的小鼠聽(tīng)力較好，原因是由于NRG1使毛細(xì)胞和螺旋神經(jīng)元間的突觸傳遞得到了增強(qiáng)［11］。

NRG1能否用于保護(hù)聽(tīng)覺(jué)中樞尤其是聽(tīng)皮層？筆者首先采用實(shí)時(shí)熒光定量RTPCR觀察NRG1在C57BL/6J小鼠聽(tīng)皮層上的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著年齡增長(zhǎng)有下降趨勢(shì)。這表明老年小鼠聽(tīng)皮層退變影響了突觸的傳遞，進(jìn)而影響了聽(tīng)皮層的功能。XU等［12］報(bào)道NRG1作為神經(jīng)保護(hù)因子，能夠保護(hù)小鼠小腦神經(jīng)元免受氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥，表明在與神經(jīng)退行性疾病有關(guān)的神經(jīng)炎癥有潛在治療應(yīng)用。為了了解NRG1的保護(hù)作用，實(shí)驗(yàn)中使用了兩種神經(jīng)保護(hù)因子，一種是NRG1，一種是臨床上已經(jīng)普遍使用的m?NGF，而生理鹽水作為對(duì)照。神經(jīng)生長(zhǎng)因子在體外實(shí)驗(yàn)中被證明能夠促進(jìn)小鼠耳蝸神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化，其在治療神經(jīng)元聽(tīng)力損失中起到了保護(hù)作用［13］。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在體外研究中也證明對(duì)耳蝸有保護(hù)作用［14］。m?NGF作為常見(jiàn)的外源性神經(jīng)生長(zhǎng)因子已被廣泛地認(rèn)為能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活和生長(zhǎng)的能力。m?NGF能夠作用于螺旋神經(jīng)元及外毛細(xì)胞進(jìn)而保護(hù)聽(tīng)力［15］。WANG等［16］研究認(rèn)為m?NGF可作為DBA/2J小鼠的保護(hù)劑用于早期干預(yù)小鼠的進(jìn)行性聽(tīng)力損失。NRG1的結(jié)果如何呢？免疫組化提示使用NRG1和m?NGF以后老年小鼠的聽(tīng)皮層神經(jīng)元上的NRG1表達(dá)明顯增高，尤其是NRG1。而通過(guò)電鏡來(lái)觀察聽(tīng)皮層的超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)生理鹽水組聽(tīng)皮層脫髓鞘改變很明顯。m?NGF組脫髓鞘好轉(zhuǎn)，而NRG1組神髓鞘扭曲情況明顯好轉(zhuǎn)。這些結(jié)果表明神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子特別是NRG1對(duì)于老年小鼠的聽(tīng)皮層還是有一定的保護(hù)作用。

雖然NRG1對(duì)于周?chē)?tīng)覺(jué)系統(tǒng)以及中樞聽(tīng)覺(jué)系統(tǒng)均顯示出一定的保護(hù)作用。然而老年性聾是個(gè)多因素疾病，NRG1能否應(yīng)用于臨床，療效如何都面臨著不小的挑戰(zhàn)。對(duì)于NRG1的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步的研究。