口蹄疫等動物疫病診斷技術研究進展

一、口蹄疫臨床癥狀和發病及流行特點

口蹄疫是一種全球性傳染病，傳播無國界，可引起巨大的經濟損失和嚴重的公共衛生問題。對國家的政治、經濟和社會有嚴重影響，故稱為“政治經濟病”。

口蹄疫（FMD）是由口蹄疫病毒（FMDV）引起的以偶蹄動物為主的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病。該病傳播迅速、發病率高，患病畜口腔黏膜、舌面、鼻鏡、蹄叉、蹄冠部及乳頭形成水泡和潰瘍爛斑。

2010年4月，日本暴發O型口蹄疫，撲殺29萬頭家畜。國寶級肉牛品牌宮崎牛幾乎絕種。損失800億日元(合人民幣62億元)，喪失保持10年無FMD局面，畜產品被禁止出口。

（一）臨床癥狀

急性經過持續一至數日，出現典型的臨床癥狀；亞急性經過可持續2、3周。FMD發病初始，往往出現精神抑郁、發熱、流涎、跛行，特征性癥狀是口、鼻、蹄及乳房等無毛部位出現水泡繼而水泡破裂，形成潰瘍、結痂，痂塊脫落后形成斑痕，繼而水泡破裂，形成潰瘍、結痂，痂塊脫落后形成斑痕。

（二）口蹄疫基本特點

1.FMD的易感動物種類繁多。包括20多個科70多個種的野生動物，重要經濟畜種豬、牛、羊、鹿、駱駝等都易感，因動物價值高，撲殺病畜阻力大，補償費用很大，欠發達地區FMD防治政策難以推進。

2.FMDV血清型多，血清型間不能交叉免疫。具有七個血清型，A、O、C、Asia1型和SAT1、SAT2和SAT3，型間不能交叉免疫保護，同型內不同病毒株的抗原性也有不同，免疫防治等于面對七種以上不同的傳染病。

3.病原變異性極強。FMDV基因組具有小RNA病毒的特性，病毒變異性強。型內不同病毒株間的遺傳變異可導致抗原差異，每逢新變異株的出現，就會導致一次新的疫情高潮。

4.FMDV的感染性和致病力特別強。極少量的病毒就能引起發病。牛只要吸入10個感染單位就可發病，病豬每天僅從呼吸道排出的病毒就高達108個感染單位，也就是說，一頭病豬一天呼出的病毒如全被牛吸入，可使1百萬頭牛發病。

5.FMD有多種傳播方式和感染途徑。FMDV主要經由呼吸道、消化道和接觸等途徑感染；與感染動物、污染的動物產品、人員、污染物及裝置的（直接或間接）接觸都可感染。氣象條件合適時，病毒可向下風方向傳播幾十甚至上百公里的距離，1981年，英國懷特（Wight）島的牛被隨風傳送的法國布列塔尼（Brittany）發病豬產生的氣溶膠病毒感染，病毒跨越英吉利海峽傳播了250 km。

6.FMD的潛伏期短，發病急。動物感染病毒后最快十幾小時就可發病排毒，感染動物能從多種途徑分泌/排泄出大量病毒，大量動物被感染集中發病令人猝不及防。

7.與其它動物病毒相比，動物機體對FMDV的免疫應答程度較低。免疫動物及發病后康復動物，再次受到同源病毒攻擊時部分動物有可能不保護；加強免疫接種也不能完全避免FMD臨床病例的出現；疫苗免疫持續期短。

8.FMDV有較強的抵抗力和存活力。FMDV對外界環境的抵抗力很強，在自然情況下含毒組織和病毒污染的飼料、飼草、皮毛及土壤等可保持傳染性達數周甚至數月之久。

9.可使反芻動物長期帶毒。加強免疫接種也不能完全避免FMD臨床病例的出現；被FMDV感染過的反芻動物會成為不表現臨床癥狀的的持續性感染動物，是一個潛在的、引發疫病暴發的病毒傳染來源。

二、口蹄疫檢測技術

口蹄疫結構蛋白抗體檢測方法包括口蹄疫阻斷ELISA方法、口蹄疫單抗競爭ELISA方法、口蹄疫膠體金試紙條。

1. 液相阻斷ELISA。1986年，Hablin等人以病毒中和實驗（VNT）和液相ELISA實驗原理，建立了液相阻斷ELISA（LB-ELISA），主要用于檢測血清中的FMD抗體。LB-ELISA現在是國際獸醫局（OIE）頒布的標準檢測方法，也是國際貿易指定的檢測方法。

液相阻斷ELISA的反應步驟優化。液相阻斷ELISA抗原抗體反應是在血清稀釋板上進行，37℃反應90 min或者4℃過夜，再轉移至酶標板上被包被抗體所捕獲，37℃反應60 min才能使抗原完全結合至酶標板上；而我們通過對反應體系的改進，抗原抗體反應在酶標板上進行，使抗原抗體的阻斷反應和抗原的捕獲在酶標上同時進行反應，極大的提高了反應效率。改進型液相阻斷ELISA將液相阻斷ELISA抗原抗體的反應時間從150 min優化至30 min，減少了反應時間和操作步驟，方便用戶實驗操作。改進型液相阻斷ELISA試劑盒使用HRP標記的一抗用于檢測阻斷抗體，相比于液相阻斷ELISA取消了酶標二抗的反應步驟，使反應步驟由兩步簡化為一步反應，反應時間由60 min減少為30 min。

2.口蹄疫分子診斷學方法。熒光定量PCR主要分為兩大類，染料法和探針法。熒光探針是在探針的5’端標記一個熒光報告基團（R），3’端標記一個淬滅基團（Q），兩者可構成能量傳遞結構，即5’端熒光基團所發出的熒光可被淬滅基團吸收或抑制，當兩者距離較遠時，抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，熒光監測系統可收到熒光信號。

口蹄疫定型熒光定量RT-PCR試劑盒特點：（1）特異性好，覆蓋面廣，能夠檢測我國及周邊國家目前主要流行毒株；（2）敏感性高，可以檢測到10個拷貝/ul；（3）更加高效，能夠在一個體系中同時鑒定目前在國內流行的口蹄疫三個型。

3. 口蹄疫單抗競爭ELISA抗體檢測試劑盒。本試劑盒的判定標準是以病毒中和實驗(VNT)為參照，經統計分析發現SPCE方法與VNT的相關性為0.93，其效價與中和效價高度相關，中和抗體與保護效力高度相關。檢測結果既可定血清型，也可以定血清抗體效價。反應特點：（1）特異性好：血清型間，無交叉反應；（2）反應譜廣：血清型內，與歷史毒株和流行毒株都很好反應。檢測特點：可測定血清型，也可測定抗體效價。

4. 口蹄疫非結構蛋白抗體檢測方法。單抗阻斷ELISA抗體檢測方法、酶聯免疫電轉移印跡試驗（EITB)或（FMDV Multi-NSPs Dot-blot）、2C3AB金標試紙條。

5. 口蹄疫分子診斷學方法。熒光定量PCR主要分為兩大類，染料法和探針法。熒光探針是在探針的5’端標記一個熒光報告基團（R），3’端標記一個淬滅基團（Q），兩者可構成能量傳遞結構，即5’端熒光基團所發出的熒光可被淬滅基團吸收或抑制，當兩者距離較遠時，抑制作用消失，報告基團熒光信號增強，熒光監測系統可收到熒光信號。

三、其他動物疫病診斷技術

1. 禽流感病毒H7N9（H7hi/H7lo/N9）三重熒光定量RT-PCR檢測試劑盒。H7N9是A型流感病毒，屬單股負鏈分節段RNA病毒，其基因組編碼至少11種蛋白，主要包括表面基因HA和NA蛋白，以及6個內部基因蛋白。H7N9是新型重組病毒，其HA來源于H7N3，NA來源于H4N9等病毒，內部基因來源于H9N2亞型禽流感病毒，該病毒可引起人和雞發病和死亡。

2. 豬病毒性腹瀉的四重熒光定量RT-PCT。豬病毒性腹瀉的病原種類繁多、感染狀況錯綜復雜，豬腸道冠狀病毒四重熒光定量RT-PCR試劑盒結合我國豬場病毒性腹瀉最新流行特點，同時檢測傳統的豬傳染性胃腸炎病毒、變異的豬流行性腹瀉病毒，以及近年來新發的豬德爾塔冠狀病毒和豬A型腸道冠狀病毒。

優點：兼容性強、根據各類病毒保守基因全新設計；特異性高，不與其他病毒基因結合；敏感性好，可檢測幾十個病毒基因拷貝數；熒光信號強、類型通用，常規熒光定量PCR儀均可使用；程序簡單、省時省力、精準高效。

3. 羊棘球蚴（包蟲）病自然感染抗體ELISA檢測試劑盒。利用蛋白質組學、代謝組學以及結合免疫學新技術，分離鑒定棘球蚴病特異性候選抗原；制備了羊棘球蚴病陽性、陰性血清；建立了羊棘球蚴病血清學間接ELISA診斷方法。

4. 豬瘟病毒間接ELISA抗體檢測試劑盒。優點：（1）相對于單抗阻斷ELISA，該試劑盒具有更好的敏感性，排除了相對單一表位抗體豐度不足時引起的假陽性；（2）相對于國內其他試劑盒，大大縮短檢測時間，2 h以內可完成檢測；（3）該試劑盒具有較好的重復性，同一血清（n=48），板內變異系數CV＜8%，板間變異系數＜10；（4）能夠準確、客觀的反應免疫效果及血清中特異性豬瘟抗體的相對含量；（5）1 000份血清結果驗證，與IDEXX、金諾阻斷比對，整體符合率在85%-90%之間。

5. 布魯氏菌cELISA抗體檢測試劑盒。布魯氏菌競爭ELISA抗體檢測試劑盒靈敏度達97.9%，是傳統方法的5～10倍，適用于對可疑樣品的檢測特異性可達96.3%，能夠有效區分與布魯氏菌存在血清學干擾的大腸桿菌O157、耶爾森氏菌O9等陽性血清。

特點：（1）《2016-2020年度國家布病防控計劃》已將競爭ELISA方法列入動物布病確診檢測方法之一；（2）本試劑盒即是通過特異性單克隆抗體與待檢血清中的抗體，競爭性結合包被在ELISA板中的布魯氏菌抗原；（3）由于其加入針對布魯氏菌的單抗，與傳統方法相比其靈敏度高、特異性強、適用于大部分易感動物如牛、羊等動物；（4）方法操作便捷、耗時短；檢測使用酶標顯色系統，結果易于判定。

四、獸醫實驗室診斷操作注意事項

（一）分子診斷實驗室的規范化設置

1. 分成不同的工作區域。每一區域都須有專用的儀器設備，專用的加樣器和槍尖等。標記清晰準確，如加樣器或試劑等。單一方向順序，從準備區、標本制備區、體系混合區及加樣區。不同的區域推薦使用不同（顏色）的工作服。實驗室的清潔應按試劑儲存和準備區至加樣區。不同區域使用各自的清潔用具。

2. 各區域的功能。（1）準備區功能：儲存試劑的制備，試劑的分裝；反應混合液的制備及分裝；加陰性對照；（2）樣本處理區功能：臨床樣本的處理（破碎）、保存；（3）核酸提取區功能：核酸提取及保存；（4）擴增區功能：將準備區分裝好的反應體系和提取的核酸混合，并加陽性對照。

3. 準備區。（1）戴手套；（2）含反應混合液的離心管在解凍前都應快速離心數秒；（3）工作結束后，必須立即對工作區進行清潔，實驗臺面紫外照射半個小時以上；（4）實驗室及設備的使用必須要有日常記錄。

4. 樣本處理區。（1）要正確使用加樣器；（2）為避免樣本間污染，最好不要同時打開多個樣本；（3）對具有潛在污染危險性的材料，必須有明確的樣本處理和滅活程序；（4）用過的加樣器槍頭必須放入專門的消毒容器中。

5. 核酸提取區。（1）RNA標本使用的槍頭離心管必須無菌且RNA-free；（2）工作臺面必須潔凈。用過的加樣器槍頭必須放入專門的消毒容器中；（3）實驗結束及時進行清潔。

6. 擴增區。（1）將制備好的核酸加入反應混合液；（2）將陽性對照加入反應混合液；（3）需在超凈臺進行；（4）加好所有樣品之后應快速離心數秒；（5）整個PCR過程在冰上操作；（6）混合體系加好后必須立即上機，不能放置。

（二）PCR污染與對策

1. 污染的預防。（1）PCR的前處理與后處理要在不同的隔離工作臺上或房間內進行；（2）分裝試劑，標記批號；（3）改進實驗操作，帶一次性手套、槍頭，槍頭不要暴露于空氣；避免反應液的飛濺；操作多份樣品時，要先將可混勻的成分一起制備成混合液；最后加入樣品，并且在加入每一管核酸后，立即蓋緊管蓋；（4）檢查結果的可重復性。

2. 污染源的追蹤。常見的環境污染源有：加樣器、清潔用具、離心機、槍尖、離心管、冰箱門把手。

3. 污染源的處理。（1）化學處理法：實驗易污染的部位或器械可用1mol/L HCL擦拭核酸降解液（隨時隨地）；（2）紫外法：紫外線照射對于長片段（500bp以上）有效，而對短片段效果不大。

4. 因操作欠規范導致的問題分析。（1）儀器使用不當引起的污染問題：①離心機：必須配平；②移液器：嚴禁大力來回擰動，嚴禁調至容量之外使用，槍頭應浸入液面2～3 mm處吸取，嚴禁將有液體的移液器平放或倒置，每周用75%乙醇清洗一次；（2）實驗室布局不合理引起的污染問題：①樣品處理不進行隔離，樣品中各種核酸片段均會通過空氣進行傳播；②儀器設備及工作服等（尤其是加樣器）公用，造成嚴重污染；③實驗室操作垃圾亂放，飄散在空氣中的核酸片段、病原微生物可造成實驗室污染。

（三）血清學方法檢測結果的影響因素

1. 試劑因素。試劑質量是影響檢測結果的直接因素，其抗原抗體的純度，標準品定值的準確性，抗體的親和力、滴度和特異性，標記物的比活性或免疫活性等。均對測定結果產生直接影響。還有試劑盒的穩定有效期，運輸條件及儲存方式等也均會對結果產生一定程度的影響。

2. 標本因素。（1）內源性因素：ELISA檢測中會出現HOOK效應，主要是由抗原或抗體過量引起，在一步法反應中頻繁出現。固相競爭ELISA克服了這種缺陷，但在檢測豬血清過程中仍偶爾出現鉤狀結果，易出現假陰性結果。這是由于血清中內源性因子非特異性結合引起的，通過高倍稀釋或加入百分之五的異源血清可以緩解內源性因子的干擾；（2）外源性因素：包括標本溶血、細菌污染、保存不當、凝集不全和添加劑的干擾作用等。

3. 實驗原理或操作方法。ELISA試劑盒操作步驟復雜，操作不當將引起較大的誤差。ELISA試劑盒操作大體分為四部分，以下敘述各個步驟中的影響因素。

（1）加樣操作的影響：加樣速度適中，避免加樣于孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快或太慢，無法保證微量加樣的準確性和均一性；加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附；濺出會對鄰近孔產生污染；出現氣泡則反應液界面有差異；

（2）溫育的影響：溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比，即溫度越高，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫，其次是43℃和2℃～8℃。溫育時間不夠，弱陽性標本檢測不出；溫育溫度不夠，弱陽性標本也難以檢出；

（3）洗板的影響：在ELISA操作中，洗板是關鍵步驟之一，可除去樣液中非特異性吸附在固相載體上的干擾物、游離的抗體和酶標記物，保證反應的定量關系，洗滌不充分直接影響檢測結果的準確性、重復性，甚至“花板”導致整個試驗失敗。因此洗板次數、注水量應符合要求，洗板方法也要正確，洗板次數也并非越多越好，拍板用的紙重復使用也可能造成污染。洗板次數較少，造成殘留，可引起假陽性結果；洗板次數過多，可造成抗原抗體結合物洗脫，造成假陽性結果。

（4）顯色的影響：影響顯色的關鍵是顯色溫度和顯色時間，顯色時間過長或過短均會造成弱陽性標本不能顯色而導致假陰性發生。ELISA實驗終止液反應后依然會引起顏色的持續變化，影響陰性和弱陽性樣品及定量檢測樣品的結果，特別在大批樣品需較長時間進行讀數時，這種潛在的顏色逐漸變化現象成為結果影響的重要因素。

4. 環境因素。（1）通風、采光與防塵；（2）環境溫度與濕度隨地理位置不同可有很大差異應使用系統空調進行控溫，并要求控制空氣濕度為40%～70%之間；（3）穩定水電，實驗過程中應采用蒸餾水(純水)或經軟化處理的自來水。