微載體規(guī)?；囵B(yǎng)PK-15細(xì)胞增殖豬圓環(huán)病毒2型LG株的研究

豬圓環(huán)病毒2型（Porcine drcovirus type 2，PCV2）可導(dǎo)致動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)功能?chē)?yán)重受損，形成免疫抑制，增強(qiáng)對(duì)其它多種病原體的易感性，使豬群發(fā)生難以控制的復(fù)發(fā)性疾病和多重感染。目前該病呈全球性流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。疫苗生產(chǎn)時(shí)的培養(yǎng)方式依然延用了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)方式，工序操作繁瑣，批間與瓶間細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的差異導(dǎo)致PCV病毒滴度的不穩(wěn)定。

生物反應(yīng)器微載體懸浮培養(yǎng)其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的傳遞更加充分均勻，細(xì)胞生長(zhǎng)及病毒增殖的培養(yǎng)環(huán)境相對(duì)優(yōu)質(zhì)、恒定，整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程控制精確，易于重復(fù)，疫苗產(chǎn)品質(zhì)量均一性高等獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，受到越來(lái)越多疫苗企業(yè)關(guān)注。本研究使用7L生物反應(yīng)器進(jìn)行PCV2的培養(yǎng)，旨在進(jìn)行生物反應(yīng)器微載體培養(yǎng)PCV工藝的摸索，為進(jìn)一步使用大容積生物反應(yīng)器微載體進(jìn)行PCV的培養(yǎng)奠定基礎(chǔ)。

一、材料與方法

1.細(xì)胞、種毒及微載體。PK-15細(xì)胞為哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司保存；PCV2-LG株為哈爾濱獸醫(yī)研究所豬病研究室提供；Cytodex 1微載體購(gòu)自美國(guó)GE公司。

2.主要試劑及儀器。胎牛血清購(gòu)自美國(guó)CLARK公司；DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司；7L細(xì)胞生物反應(yīng)器購(gòu)自荷蘭Applicon公司；豬圓環(huán)病毒2型抗原檢測(cè)試劑盒購(gòu)自哈爾濱獸醫(yī)研究所；其余試劑為分析純。

3.PK-15細(xì)胞微載體培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PK-15細(xì)胞用胰酶消化脫壁，加入含10%新生牛血清的MEM營(yíng)養(yǎng)液重懸并計(jì)數(shù)。在250 ml攪拌瓶中分別加入濃度為1、3和5 g/L的微載體（按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行水化及滅菌處理），細(xì)胞初始接種密度為0.3×106cells/ml，每天取樣進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，即吸取搖勻后的細(xì)胞懸液1 mL置于EP管中，1 000 r/min，離心5 min后棄上清，加入1 ml 1%結(jié)晶紫溶液并混勻，37℃孵育1 h后，用移液槍吹打使微載體上的細(xì)胞脫落并保證細(xì)胞核全部釋放，稀釋后用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)釋放的細(xì)胞核，即為細(xì)胞密度，并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

4.不同接毒時(shí)間對(duì)病毒滴度的影響。將PK-15細(xì)胞以0.3×106cells/ml的密度接種于250 ml攪拌瓶中，微載體用量為3 g/L。分別在細(xì)胞生長(zhǎng)0 h、6 h和12 h，以MOI為0.05接種PCV病毒，接毒后48 h，用無(wú)血清的MEM培養(yǎng)液換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)，接毒后每24 h取樣測(cè)定PCV的效價(jià)。

5.接種不同MOI病毒對(duì)病毒滴度的影響。將PK-15細(xì)胞以0.3×106cells/ml的密度接種于250 ml攪拌瓶中，微載體用量為3g/L。待細(xì)胞生長(zhǎng)6 h后，分別以MOI為0.01、0.05和0.2接種PCV2病毒，接毒后48 h，用無(wú)血清的MEM培養(yǎng)液換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)。接毒后每24 h取樣測(cè)定PCV的效價(jià)，確定最佳收獲病毒時(shí)間。

6.生物反應(yīng)器培養(yǎng)接種PCV2。根據(jù)攪拌瓶中摸索的病毒增殖工藝，在7L生物反應(yīng)器中驗(yàn)證其工藝的可行性。微載體用量為3g/L，細(xì)胞接種密度為0.3×106cells/ml，細(xì)胞接種6 h后以MOI為0.05接種PCV2病毒，接毒后48 h，用無(wú)血清的MEM培養(yǎng)液換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)72 h收獲病毒液。生物反應(yīng)器操作參數(shù)控制為DO 50%，攪拌速度100 r/min，溫度37℃，pH值7.2。

7.IPMA法檢測(cè)PCV病毒滴度。將病毒液用無(wú)血清MEM細(xì)胞培養(yǎng)液做10倍系列稀釋?zhuān)?0-4、10-5、10-63個(gè)稀釋度，各接種96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)稀釋度接種6孔，每孔100μl，同時(shí)設(shè)6孔無(wú)病毒作為健康細(xì)胞對(duì)照。每孔加入100μl新消化的PK-15細(xì)胞懸液，培養(yǎng)液為含10%新生牛血清的MEM。培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)單層，用冷的甲醇固定，一抗為PCV2抗體，二抗為FITC熒光抗體，AEC底物顯色液室溫顯色，置顯微鏡下觀察染色結(jié)果。結(jié)果判定：陽(yáng)性細(xì)胞孔內(nèi)可觀察到陽(yáng)性細(xì)胞的胞漿或胞核內(nèi)有典型的紅棕色著染，而陰性對(duì)照、空白對(duì)照的細(xì)胞孔內(nèi)無(wú)紅棕色著染。

二、結(jié)果

1.不同濃度微載體對(duì)PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。當(dāng)初始細(xì)胞密度為0.3×106cells/ml，微載體用量分別為1、3和5 g/L時(shí)，PK-15細(xì)胞在微載體上生長(zhǎng)曲線如圖1所示。微載體濃度為1 g/L時(shí)，細(xì)胞快速進(jìn)入生長(zhǎng)期，但由于接種后細(xì)胞存在聚團(tuán)和游離細(xì)胞不黏附的現(xiàn)象，雖然單個(gè)微載體上分配的細(xì)胞個(gè)數(shù)很多，但不能提供有效的黏附生長(zhǎng)表面，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。微載體濃度為5 g/L時(shí)，PK-15細(xì)胞的延遲期延長(zhǎng)，這是由于單個(gè)微載體上分布的細(xì)胞過(guò)少，細(xì)胞生長(zhǎng)缺乏初始密度效應(yīng)而造成生長(zhǎng)相對(duì)緩慢，最大細(xì)胞密度也最低。所以最合適的微載體濃度為3g/L，能均勻分布細(xì)胞于每個(gè)微載體表面，促使細(xì)胞快速生長(zhǎng)，同時(shí)也為細(xì)胞的生長(zhǎng)預(yù)留了充裕的生長(zhǎng)表面，最終獲得較好的培養(yǎng)效果。

圖1 不同濃度微載體PK-15細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.不同接毒時(shí)間對(duì)病毒滴度的影響。不同接毒時(shí)間對(duì)PCV2增殖效價(jià)的影響結(jié)果如表1所示。分別在細(xì)胞培養(yǎng)后0、6和12小時(shí)接種病毒，其所對(duì)應(yīng)的最高病毒滴度分別為106.5、106.5和106.5。細(xì)胞接種后6 h接種PCV2為最佳接毒時(shí)間，其收獲的最大病毒滴度顯著高于其余兩組。雖然理論上細(xì)胞數(shù)越多，其所收獲的病毒也應(yīng)該最多，但PPV病毒只在一定范圍內(nèi)滿(mǎn)足此規(guī)律，說(shuō)明細(xì)胞密度并不是決定病毒滴度的決定性因素，而是細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。

表1 不同接毒時(shí)間對(duì)病毒滴度的影響

3.接種不同MOI病毒對(duì)病毒滴度的影響。不同感染復(fù)數(shù)對(duì)PCV2增殖效價(jià)的影響結(jié)果如表2所示。過(guò)高或過(guò)低的感染復(fù)數(shù)（0.2和0.01）均導(dǎo)致較低的PCV2增殖效價(jià)，說(shuō)明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。感染復(fù)數(shù)為0.05 h可以獲得較高的PCV2增殖效價(jià)，達(dá)到106.5TCID50/ml。此外各組試驗(yàn)結(jié)果均顯示，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加病毒毒價(jià)逐漸升高，說(shuō)明換液后72 h可以作為收獲病毒的最適時(shí)間。

表2 接種不同MOI病毒對(duì)病毒滴度的影響

4.7 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)接種PCV2。對(duì)7 L生物反應(yīng)器培養(yǎng)PCV2進(jìn)行病毒滴度測(cè)定，各時(shí)間病毒滴度如表3所示。與250 ml攪拌瓶病毒增殖趨勢(shì)相同，病毒滴度也是隨著時(shí)間增加逐漸升高，接毒72 h病毒滴度達(dá)最高值。

表3 7L生物反應(yīng)器中PCV2病毒滴度

三、討論

在細(xì)胞微載體懸浮培養(yǎng)的初期，細(xì)胞與微載體的接觸及黏附是一種物理性碰撞過(guò)程，控制合適的微載體與初始細(xì)胞量的比例可以達(dá)到較好的培養(yǎng)效果。本研究中發(fā)現(xiàn)微載體濃度過(guò)小會(huì)增加傳代次數(shù)，不符合生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)性；微載體濃度過(guò)大時(shí)，培養(yǎng)過(guò)程中微載體相互聚集、碰撞，使死細(xì)胞數(shù)量增加。微載體濃度為3 g/L時(shí)可以獲得均勻的細(xì)胞分布效果，細(xì)胞黏附充分，并預(yù)留了適度的細(xì)胞生長(zhǎng)空間，細(xì)胞增殖密度和細(xì)胞存活率均獲得最好的水平。

選擇合適的接毒時(shí)間至關(guān)重要，進(jìn)行PCV2培養(yǎng)時(shí)，應(yīng)在細(xì)胞接種或未形成單層之前接種。細(xì)胞接種后0 h以MOI為0.05接種PCV2病毒，接種病毒時(shí)間較早，嚴(yán)重影響了細(xì)胞的正常生長(zhǎng)，病毒毒價(jià)較低；細(xì)胞接種后12 h以MOI為0.05接種PCV2病毒，細(xì)胞密度有所提高，雖然理論上細(xì)胞數(shù)越多，其所收獲的病毒也應(yīng)該最多，但病毒毒價(jià)并沒(méi)有細(xì)胞接種后6 h接種PCV2高。說(shuō)明細(xì)胞密度并不是決定病毒滴度的決定性因素，而是細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。這主要是由于PCV2病毒在增值子代病毒時(shí)需要宿主細(xì)胞DNA復(fù)制相關(guān)的酶參與，只有細(xì)胞處于指數(shù)生長(zhǎng)前期時(shí)其DNA復(fù)制酶的活性最局，數(shù)量最多。

本研究摸索了利用微載體規(guī)模培養(yǎng)PK-15細(xì)胞增殖PCV2 LG株的條件，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定最佳接毒時(shí)間為細(xì)胞接種后6 h，最佳接毒劑量為MOI=0.05，在此條件下增殖病毒含量最高可達(dá)106.5，表明PCV2 LG株適應(yīng)在PK-15細(xì)胞內(nèi)大規(guī)模增殖，為以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為基質(zhì)大規(guī)模增殖病毒及制備豬圓環(huán)病毒疫苗提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)（略）