凝結芽孢桿菌復合干酪乳桿菌發酵南瓜飲料的研制

馬欣,古紹彬,2,3*,吳影,2

1(河南科技大學 食品與生物工程學院，河南 洛陽，471023)2(食品加工與安全國家級實驗教學示范中心，河南 洛陽，471023) 3(洛陽市微生物發酵工程技術研究中心，河南 洛陽，471023)

南瓜(Cucurbitamoschata)是葫蘆科(Cucurbitaceae)南瓜屬，1年生雙子葉蔓性草本植物，又稱倭瓜、金冬瓜等。南瓜營養成分豐富且全面，在三大產熱營養素中，以碳水化合物為主，且脂肪含量較低[1]。此外還含果膠、纖維素、淀粉、蛋白質、β-胡蘿卜素、礦物質、戊聚糖、甘露醇、腺嘌呤、南瓜多糖及多種氨基酸等成分[2-5]。

據聯合國糧食及農業組織FAOSTAT數據顯示，2014年我國肉用南瓜生產面積80萬公頃左右，總產量超過2 900萬t，居世界第一，然而利用率卻極低，產業鏈不長，這不僅嚴重制約了我國南瓜產業的發展，還導致了資源的極大浪費[6]。目前，果蔬型發酵飲料由于綜合了果蔬汁和乳酸發酵的優點，在歐美、日本等發達國家廣受歡迎，得到廣泛研究與開發[7]。因此，以南瓜為原料，以我國衛計委新批準的人用益生凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)和健康三益菌之一的干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)為發酵劑，研制發酵型南瓜飲料，不僅能為南瓜資源的綜合利用提供有力支撐，還可豐富國內活菌飲料產品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蜜本南瓜，采購于當地農貿市場；凝結芽孢桿菌(Bacilluscoagulans)CGMCC 9951和干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)LC102為本實驗室保藏菌種。

β-胡蘿卜素標準品，北京索萊寶科技有限公司；生理體液氨基酸、蛋白水解氨基酸標準品，德國Membra Pure公司；所有分離用有機試劑均為國產分析純；纖維素酶，酶活單位50 000 U/g，果膠酶，酶活單位20 000 U/g，葡萄糖淀粉酶，酶活單位100 000 U/g 3種酶均購于上海藍季科技發展有限公司。

1260型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；A300型全自動氨基酸分析儀，德國Membra Pure公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及種子制備

將凝結芽孢桿菌接種于改良LB培養基中，37 ℃，230 r/min恒溫振蕩培養18 h；將干酪乳桿菌接種于MRS培養基中，37 ℃靜置培養18 h。

1.2.2 發酵型南瓜飲料制備工藝流程及操作要點

選用肉質橘黃、無病蟲腐蝕的成熟南瓜為原料，清凈后除去表皮及種籽，將瓜肉處理為0.5 cm厚度的瓜片，并置于沸水中熱燙5 min，使組織充分軟化。軟化后按料水比1∶2(g∶mL)加水打漿，添加1.8%纖維素酶、0.3%果膠酶、0.25%葡萄糖淀粉酶于南瓜汁中，50 ℃水浴酶解3 h[8]。酶解完成后于100 ℃滅菌10 min[9]，冷卻至室溫然后接種發酵，發酵結束后于4 ℃冰箱冷藏保存。

1.2.3 南瓜汁中凝結芽孢桿菌發酵特性研究

將凝結芽孢桿菌以3%(活菌數約為1×107CFU/mL)的接種量添加到經前處理的南瓜汁中，于37 ℃，230 r/min培養24 h，每隔2 h取樣監測發酵南瓜汁中菌落總數、pH、可滴定酸及還原糖等的變化。

1.2.4 凝結芽孢桿菌和干酪乳桿菌偶聯發酵工藝

以上述凝結芽孢桿菌單菌發酵特性研究為基礎，以干酪乳桿菌接種量、偶聯發酵時間、偶聯發酵溫度為影響因素，考察各因素對菌落總數的影響，確定各個影響因素的范圍，以發酵南瓜飲料的活菌總數為響應值，通過Box-Behnken試驗設計對偶聯發酵工藝進行優化。

1.3 發酵過程參數的測定

凝結芽孢桿菌、干酪乳桿菌活菌總數測定：平板稀釋活菌計數法。活菌總數：凝結芽孢桿菌與干酪乳桿菌活菌總數之和；pH測定：采用PH400基礎型臺式pH計；可滴定酸度測定：用已標定的0.1 mol/L/NaOH標準溶液進行酸堿滴定；還原糖測定：采用DNS法測定還原糖含量[10]；南瓜粗多糖：熱水浸提法[11]；多酚含量：福林酚試劑法[12]；Vc含量：2，6-二氯酚靛酚滴定法[13]。

β-胡蘿卜素：高效液相色譜法[14]。色譜條件：色譜柱：ZORBAX SB-C18250 mm×4 mm,5 μm。流動相A: 甲醇，流動相 B：乙酸乙酯。洗脫順序：0～20 min，90%～85%A;20～30 min，85%～70%A。柱溫：25 ℃，檢測波長：450 nm，流速：1.2 mL/min，進樣量：10 μL。

氨基酸含量測定：高效陽離子交換色譜(HPCEC)-柱后茚三酮衍生化法[15]，鋰鹽體系同時測定游離氨基酸與水解氨基酸，進樣量20 μL。

2 結果與分析

2.1 復合酶添加對南瓜汁出汁率和還原糖含量的影響

南瓜中碳水化合物占南瓜干物質量的60%左右，果膠約占10%～15%，纖維素約占10%。為提高南瓜的出汁率和南瓜汁的可發酵性，本研究在單一酶添加量的基礎上，即1.8%纖維素酶，0.3%果膠酶，0.25%葡萄糖淀粉酶，采用兩兩組合和三三組合進行復合酶解試驗。結果如圖1所示，復合酶處理可以顯著提高南瓜出汁率和還原糖含量，其中三酶復合酶解時，還原糖含量和出汁率分別達到22.78 g/L和85.45%，較未酶解南瓜汁的還原糖含量和出汁率有顯著提高。

1-未酶解南瓜汁；2-纖維素酶；3-果膠酶；4-糖化酶；5-果膠酶+纖維素酶；6-果膠酶+糖化酶；7-纖維素酶+糖化酶；8-纖維素酶+糖化酶+果膠酶圖1 復合酶對還原糖含量及出汁率的影響Fig.1 Effect of complex enzymes on reducing sugar content and juice yield

2.2 復合益生菌發酵南瓜飲料工藝研究

2.2.1 凝結芽孢桿菌發酵特性研究

將活化后的凝結芽孢桿菌接種于經酶解滅菌后的南瓜汁中。如圖2所示，在前4 h菌體處于適應期，生長緩慢，還原糖消耗較低，隨著進入對數生長期，菌體密度迅速增長，培養基中還原糖含量持續下降，當培養到16 h時，菌體密度接近最大值，達到6.5×108CFU/mL。此后，盡管培養基中還含較多的還原糖，但2 h后活菌數仍開始緩慢下降，這可能是由于隨著發酵時間延長，菌體利用南瓜汁中糖代謝產生了包括L-乳酸在內的大量有機酸[16]，從而導致了發酵醪中pH急劇下降，在10 h時pH值已降為4.27，可滴定酸達到了0.54%(見圖3)。

圖2 凝結芽孢桿菌發酵過程中活菌數及還原糖的變化Fig.2 Changes of viable count and reducing sugar in fermentation of Bacillus coagulans

圖3 凝結芽孢桿菌發酵過程中pH及可滴定酸的變化Fig.3 Changes of pH and titratable acid during fermentation of Bacillus coagulans

2.2.2 干酪乳桿菌發酵特性研究

將活化后的干酪桿菌接種于經酶解滅菌后的南瓜汁中，可觀察到類似于凝結芽孢桿菌的曲線(見圖4)，至發酵后期，pH降至3.3左右，可滴定酸含量達到1.2%(見圖5)，說明其產酸能力明顯強于凝結芽孢桿菌CGMCC 9951。因此為保證發酵型南瓜飲料中有足夠的凝結芽孢桿菌的活菌數，擬采用兩菌偶聯發酵工藝，即先接種凝結芽孢桿菌，待前者生長到對數生長后期后，再接種干酪乳桿菌。為此，本文進行了干酪乳桿菌接種量、偶聯發酵時間、偶聯發酵溫度等對活菌總數影響的相關研究。

圖4 干酪乳桿菌發酵過程中活菌數及還原糖的變化Fig.4 Changes of viable count and reducing sugar in Fermentation of Lactobacillus casei

圖5 干酪乳桿菌發酵過程中pH及可滴定酸的變化Fig.5 Changes of pH and titratable acid in Fermentation of Lactobacillus casei

2.2.3 偶聯發酵單因素試驗

2.2.3.1 干酪乳桿菌接種量對活菌總數的影響

接種量對菌體的生長繁殖影響顯著，尤其在耦合發酵工藝中，后續接種的微生物，其接種量更是影響發酵能否成功的關鍵。研究結果如圖6所示，活菌總數隨著接種量的增加，呈現先增加后減小的趨勢。當接種量大于3%時，活菌總數明顯下降，這主要由于接種量增加，導致了干酪乳桿菌早期快速生長繁殖，引起發酵液中產酸量急劇增加，一方面導致菌體生長代謝被抑制，另一方面也誘發部分菌體出現自溶和衰退現象[17]。因此干酪乳桿菌最適接種量為3%(V/V)，此時活菌總數為2.23×109CFU/mL，凝結芽孢桿菌活菌數為1.67×109CFU/mL。

圖6 不同接種量對活菌總數的影響Fig.6 Effects of different inoculation amount on total viable count注：偶聯發酵時間為6 h，偶聯發酵溫度為37 ℃

2.2.3.2 偶聯發酵時間對活菌總數的影響

由于干酪乳桿菌LC102產酸能力較凝結芽孢桿菌CGMCC 9951強，且后者的酸耐受能力弱于前者，因此凝結芽孢桿菌生長到對數生長期后再開始接入干酪乳桿菌后，共培養時間長短成為決定耦合工藝是否成功的又一關鍵因素，結果如圖7所示。隨著發酵時間的延長，活菌總數呈先增大后降低的趨勢，偶聯發酵8 h達到最大值3.37×109CFU/mL，此時凝結芽孢桿菌活菌數為1.95×109CFU/mL。

圖7 不同發酵時間對活菌總數的影響Fig.7 Effects of different fermentation time on the total viable count注：干酪乳桿菌接種量為3%，偶聯發酵溫度為37 ℃

2.2.3.3 偶聯發酵溫度對活菌總數的影響

對于偶聯發酵而言，偶聯培養溫度對發酵十分關鍵，溫度過高或過低都會影響發酵菌株生長及代謝情況。研究結果如圖8所示，當溫度為22～37 ℃時，菌體的生長繁殖隨溫度的上升增加，隨著溫度繼續增加時，活菌總數開始降低，當溫度維持在37 ℃時活菌總數和凝結芽孢桿菌總數分別達到3.33×109和1.97×109CFU/mL。

圖8 不同發酵溫度對活菌總數的影響Fig.8 Effect of fermentation temperature on the total number of viable count注：干酪乳桿菌接種量為3%，偶聯發酵時間為8 h

2.2.4 響應面優化試驗結果與分析

2.2.4.1 響應面試驗方案及結果

根據Bo-Benhnken試驗設計，在單因素試驗設計的基礎上，選擇干酪乳桿菌接種量(A)、偶聯發酵時間(B)、偶聯發酵溫度(C)為自變量，以活菌總數為響應值，采用響應面分析法對發酵工藝條件進行優化。試驗因素水平表見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Variables and levels of response surface analysis

根據表1的試驗因素與水平設計，進行三因素三水平的響應面試驗，具體方案及結果見表2。

利用Design Expert軟件對表2試驗結果進行二次多項式擬合，根據各項的回歸系數，獲得的二次回歸模型方程為：

X=3.13+0.089A+0.025B+0.091C-0.098AB-0.25AC-0.073BC-0.70A2-0.52B2-0.41C2。

其中：X,活菌總數,109CFU/mL；A,干酪乳桿菌接種量,%；B,發酵時間,h；C,發酵溫度,℃。

表2 響應面分析試驗結果Table 2 Results of respose surface analysis

2.2.4.2 響應面模型的分析

如表3的方差分析所示，該回歸模型F值為89.11，prob>F值小于0.000 1，從而可以表明該模型達到極顯著的水平，同時，該模型失擬項不顯著p>0.1，決定系數R2=0.991 3，表明數據與模型擬合良好、模型可用。回歸模型系數的顯著性分析結果表明，AC、A2、B2、C2對活菌總數影響極顯著，A、C、AB對活菌總數影響顯著，B、BC對活菌總數影響不顯著。對活菌總數影響的主次因素依次為偶聯發酵溫度>接種量>偶聯發酵時間。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance table

注：**代表差異極顯著p<0.01；*代表差異顯著0.01

2.2.4.3 各因素間的交互作用分析

如圖9～圖11，為各因素間交互作用對發酵南瓜飲料活菌總數的影響。由圖可知，各因素之間的交互作用都隨著因素水平的增加，活菌總數呈先增加后降低的趨勢。接種量(A)和偶聯發酵溫度(C)、接種量(A)和偶聯發酵時間(B)等高線圖趨于橢圓形，說明其交互作用較強，對活菌總數的影響較大。而發酵時間(B)和發酵溫度(C)之間的交互對活菌總數影響則相對較小。

圖9 接種量與發酵時間交互作用響應面圖Fig.9 The 3D-surface showing the interaction between inoculum and fermentation time

圖10 接種量與發酵溫度交互作用響應面圖Fig.10 The 3D-surface showing the interaction between inoculum and fermentation temperature

圖11 發酵時間與發酵溫度交互作用響應面圖Fig.11 The 3D-surface showing the interaction between fermentation time and fermentation temperature

2.2.4.4 發酵最佳工藝的優化與驗證試驗

利用Design Expert軟件進行分析，得到發酵南瓜飲料最佳工藝條件是接種量3.05%(V∶V)、發酵時間8.03 h、發酵溫度37.48 ℃，在此條件下活菌總數的預測值為3.135×109CFU/mL。考慮到試驗操作的實際情況，將各參數稍作調整，即接種量3%(V∶V)、發酵時間8 h、發酵溫度37.5 ℃。為了驗證響應面分析最佳條件的準確性和可靠性，按上述最佳工藝條件進行3次重復試驗。結果顯示，3次重復試驗的平均值為(2.98±0.65)×109CFU/mL,與3.135×109CFU/mL接近，說明該模型準確可靠。

對優化后的發酵南瓜飲料的理化指標進行測定，結果見表4。

表4 發酵南瓜飲料的理化指標Table 4 The physicochemical index of fermentedpumpkin beverage

2.3 發酵型南瓜飲料功能成分研究

眾所周知，南瓜富含多種營養成分，如氨基酸、多糖、多酚以及活性成分,如β-胡蘿卜素，經發酵后的南瓜飲料的上述物質保留情況是決定其品質的又一重要因素。經測定發酵型南瓜飲料中粗多糖含量(見表5)與未經發酵的南瓜中粗多糖的含量較為接近,可達到1.5%。β-胡蘿卜素、Vc是重要的抗氧化物質，經發酵后兩者均得到較好的保留。

表5 發酵前后南瓜飲料功能成分含量變化Table 5 Changes of functional composition of unfermentationand fermentation pumpkin drink

南瓜中含有人體所需的多種氨基酸。本文研究發酵前后南瓜飲料中游離氨基酸、水解氨基酸的變化情況，由表6、表7可知，發酵南瓜汁中富含18種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸和兒童必需的組氨酸，以及谷類食物較易缺乏的賴氨酸。此外，本研究發現發酵南瓜飲料還含有具有降血壓、抗驚厥、鎮痛和改善記憶等多種藥理作用的γ-氨基丁酸。

3 結論

表6 南瓜汁發酵前后水解氨基酸檢測結果表 Table 6 The results of hydrolytic amino acids test inunfermentation and fermentation pumpkin drink

表7 南瓜汁發酵前后游離氨基酸檢測結果表Table 7 The results of free amino acids test in unfermentationand fermentation pumpkin drink

注：“-”表示不存在此種游離氨基酸。

本研究以南瓜為原料，通過纖維素酶、果膠酶、葡萄糖淀粉酶復合酶解獲得可發酵性糖為22.78 g/L的南瓜汁發酵醪液。在單因素試驗的基礎上，以活菌總數為響應值，采用Box-Benhnken設計優化發酵南瓜飲料工藝條件。以3%(V∶V)的接種量接種凝結芽孢桿菌CGMCC9951，培養16 h后再以相同接種量接種干酪乳桿菌LC102，進行8 h偶聯發酵，最終獲得活菌總數為3.072×109CFU/mL，凝結芽孢桿菌為1.89×109CFU/mL的發酵南瓜活菌飲料。通過對其中營養功能成分測定，發酵南瓜飲料功能成分得到較好保留。氨基酸分析儀分析結果表明，發酵南瓜飲料富含18種氨基酸，其中包括人體必需的8種氨基酸以及兒童必需的組氨酸和谷類食物較易缺乏的賴氨酸。本方法研制的發酵南瓜飲料，采用我國新批準的人用益生凝結芽孢桿菌和干酪乳桿菌進行混合發酵，開發出營養豐富的發酵飲品，為南瓜利用提供支撐，同時為凝結芽孢桿菌在食品中的應用提供一定參考。