Caspase-3與肝癌細胞的凋亡研究

張 靚

（江西省九江市第一人民醫(yī)院病理科，江西 九江 332000）

本課題以人體原發(fā)性肝癌作為研究對象，以關鍵蛋白酶Caspase-3作為切入點，分析Caspase-3在肝癌中的表達與肝癌細胞凋亡的相關性，闡明Caspase-3在肝癌細胞凋亡中作用及其機制，為肝癌的基礎研究提供可靠的理論基礎和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本資料：選取本院2009年1月至2014年12月開展手術切除治療的原發(fā)性肝癌（HCC）患者87例，均行組織病理學確診符合《原發(fā)性肝癌》（2013年）診斷標準[1]。男性65例，女性22例，年齡37～79歲，平均年齡（53.08±4.95）歲。Edmondson組織學分級：64例Ⅰ～Ⅱ級，23例Ⅲ～Ⅳ級。本次入選病例手術前均未實施免疫制劑、放療、化療。取癌組織87例（觀察組），癌旁組織58例（對照組），取肝內膽管結石擴張膽管旁正常肝組織21例（參考組）。

1.2 方法：全部均為術中取新鮮組織樣本，4%中性多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，4 μm厚組織切片。①Caspase-3表達：實施免疫組織化學（S-P）法檢測，選用中杉金橋（北京）生產的S-P（SP9001）免疫組化染色試劑盒，按流程規(guī)范操作。②細胞凋亡：實施原位末端標記技術（TUNEL）法檢測，選用博士德生物公司生產的POD細胞凋亡檢測試劑盒（NK1020），按流程規(guī)范操作。

1.3 評價標準：Caspase-3表達結果判定：高倍鏡（200倍）觀察，細胞質、膜呈黃色顆粒為陽性，①陽性細胞著色：0分未著色，1分呈淡黃色，2分黃色，3分為棕黃色。②陽性細胞整體比例評估，0分：陽性細胞＜1.0%，1分：陽性細胞1%～10%，2分：陽性細胞11%～50%，3分：陽性細胞51%～80%，4分：陽性細胞＞80%。依據(jù)IRS法計算，將兩項評分項目相之和作為判定結果，陰性（-）：0分，弱陽性（+）：1～4分，陽性（++）：5～8分，強陽性（+++）：9～12分。細胞凋亡結果判定：高倍鏡（200倍）觀察，細胞核呈黃色顆粒為陽性，屬凋亡細胞；隨機性抽選10個高倍視野進行細胞計數(shù)（800個腫瘤細胞），計算細胞凋亡指數(shù)（AI），其中AI計算方式為AI=凋亡細胞/800×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法：數(shù)據(jù)納入SPSS19.0軟件分析，χ2、t檢驗，（P＜0.05）差異顯著，有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組Caspase-3表達情況比較：經檢測，觀察組肝細胞內Caspase-3表達陽性率39.1%（34例），對照組肝細胞內Caspase-3表達陽性率70.7%（41例），參考組肝細胞內Caspase-3表達陽性率80.9%（17例），觀察組Caspase-3表達陽性率與對照組（參考組）均有明顯差異（P＜0.05）；對照組與參考組Caspase-3表達陽性率無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組Caspase-3表達情況比較[n（%）]

2.2 HCC肝癌Caspase-3表達與AI關系分析：將87例HCC患者按照Caspase-3表達結果進行分組，其中Caspase-3表達陽性組34例，Caspase-3表達陰性組53例，比較兩組細胞凋亡指數(shù)變化，結果證實，Caspase-3表達陽性組與Caspase-3表達陰性組AI有明顯差異性（P＜0.05），二者呈負相關（-0.924，P=0.001）。見表2。

表2 HCC肝癌Caspase-3表達與AI關系分析（±s）

表2 HCC肝癌Caspase-3表達與AI關系分析（±s）

組別 n AI(%)Caspase-3表達陽性組 34 5.67±3.79 Caspase-3表達陰性組 53 2.76±1.62 t 4.9418 P 0

3 討 論

Caspase-3被認為是處于凋亡途徑的核心環(huán)節(jié)和終末效應器酶，屬關鍵蛋白酶。動物實驗表明，缺乏Caspase-3小鼠表現(xiàn)為腦內細胞過度增生和細胞發(fā)育失去有序性。為此有學者指出，Caspase依賴的細胞凋亡相關腫瘤和疾病有可能作為臨床治療腫瘤的又一新靶點。研究證實[2]，Caspase-3在各類腫瘤及相關細胞系內均存在表達缺失現(xiàn)象，并與細胞凋亡抵抗現(xiàn)象及細胞對藥性耐藥抵抗有明顯關聯(lián)。如易娟等[3]檢測乳腺癌Caspase-3表達情況，認為Caspase-3表達缺失將造成癌細胞凋亡抵抗；而白血病、宮頸癌、淋巴母細胞瘤等Caspase-3表達處于未激活狀態(tài)，將限制癌細胞對各類化療藥物所誘導的凋亡效果，甚至發(fā)生化療抵抗。夏鈺弘等[4]研究通過原位雜交法對HCC患者Caspase-3表達檢測，發(fā)現(xiàn)HCC肝細胞呈低表達，而健康肝組織細胞內Caspase-3表達陽性較高，由此推導HCC的病發(fā)可能與Caspase-3表達缺失有著關聯(lián)。本研究結果亦證實，HCC病灶組織內Caspase-3表達陽性率與癌旁組織及正常肝組織均有明顯差異；這一結果也與夏鈺弘研究相符。證實Caspase-3表達缺失可造成肝癌細胞凋亡障礙，側面反映了Caspase-3表達將誘導HCC癌細胞生長。

細胞凋亡主要經由基因控制的生物正常細胞自限性死亡特征，同時也是保障生物內環(huán)境調節(jié)穩(wěn)定的機制。細胞凋亡是一個復雜過程，可受多種因素誘導所致，其中Caspase是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，以蛋白底物裂解、細胞解體為結局，而Caspase-3則是細胞凋亡效應產生的初始執(zhí)行者，重點對多個關鍵點進行酶切[5]。本研究比較HCC肝細胞Caspase-3表達陽性患與陰性表達細胞凋亡指數(shù)變化，結果證實Caspase-3表達陽性與Caspase-3表達陰性者在肝癌細胞內AI有明顯差異性，二者呈負相關；表明Caspase-3能夠影響HCC病變，對肝細胞凋亡產生直接的作用。

綜上所述，Caspase-3表達缺失將造成肝癌細胞凋亡遲緩或紊亂，誘導HCC的病變及惡性進展。