高表達(dá)水通道蛋白7的脂肪細(xì)胞的脂代謝的研究

白曉蘇 黎智森

[摘要] 目的 研究高表達(dá)AQP7的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞的脂代謝變化。 方法 構(gòu)建高表達(dá)的AQP7的 3T3-L1 脂肪細(xì)胞，測(cè)定AQP7mRNA和AQP7蛋白表達(dá)的變化，以及脂代謝指標(biāo)甘油和脂肪酸的變化。 結(jié)果 與對(duì)照組比較AQP7mRNA和AQP7蛋白表達(dá)明顯增加差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），培養(yǎng)基中甘油的水平也升高差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），脂肪酸的水平無(wú)變化差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。 結(jié)論 高表達(dá)的AQP7蛋白，可顯著減少脂肪細(xì)胞內(nèi)甘油，減少脂肪細(xì)胞體積，減輕胰島素抵抗。

[關(guān)鍵詞] 脂肪細(xì)胞；水通道蛋白7；甘油

[中圖分類號(hào)] R58 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1672-4062（2018）01（b）-0025-02

隨著生活環(huán)境的改變，2 型糖尿病的（T2DM）的發(fā)生逐漸增加，T2DM是心腦血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。肥胖與T2DM的發(fā)生密不可分，胰島素抵抗是二者的共同土壤，脂肪細(xì)胞的體積肥大和脂肪細(xì)胞數(shù)量的增加是引起體內(nèi)脂肪蓄積及代謝異常的重要誘因[1-2]。脂肪細(xì)胞內(nèi)的與甘油轉(zhuǎn)運(yùn)的的水通道蛋白7（AQP7）表達(dá)的下降，與肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病的形成有關(guān)。該文將探討高表達(dá)AQP7的3T3-L1 脂肪細(xì)胞的脂代謝的變化。

1 材料與方法

1.1 材料

pMD18T載體；Lipofectamine 2000及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)染試劑盒；3T3脂肪細(xì)胞。PCR儀，熒光定量?jī)x。RNA 提取及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自TaKaRa 公司；抗AQP7 抗體購(gòu)自艾博抗貿(mào)易有限公司，甘油含量酶法測(cè)定試劑盒購(gòu)自普利萊基因有限公司； 游離脂肪酸測(cè)定試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所，其余試劑為市售分析純。

1.2 方法

高表達(dá)APQ7的3T3脂肪細(xì)胞的建立對(duì)合成ap2的-63bp/5.4-4.9kb的啟動(dòng)調(diào)節(jié)區(qū)和AQP7基因的CDS區(qū)全序列進(jìn)行分析，構(gòu)建載體 ap2-AQP7。 構(gòu)建的腺病毒表達(dá)載體ap2-AQP7經(jīng)Pac I消化后Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，包裝病毒，收集病毒原液，并采用免疫法檢測(cè)腺病毒滴度，以不含ap2-AQP7的空載腺病毒作為陰性對(duì)照。轉(zhuǎn)染載體ap2-AQP7的3T3-L1 脂肪細(xì)胞培養(yǎng)至生長(zhǎng)狀態(tài)良好后，進(jìn)行誘導(dǎo)分化。病毒感染3T3脂肪細(xì)胞后48 h收集細(xì)胞，行RT-Q-PCR檢測(cè)，估算目的基因含量，建立高表達(dá)的APQ7的3T3脂肪細(xì)胞模型。

測(cè)定脂肪細(xì)胞的AQP7的蛋白水平以及甘油、FFA 的含量的測(cè)定用試劑盒檢測(cè)AQP7的蛋白水平，以及測(cè)定培養(yǎng)基的甘油、游離脂肪酸的含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用 SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示行t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3T3脂肪細(xì)胞的AQP7mRNA以及蛋白的表達(dá)的變化與對(duì)照組比較

試驗(yàn)組的AQP7mRNA和AQP7蛋白的表達(dá)明顯高于對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。見(jiàn)圖1。

2.2 培養(yǎng)基的甘油、脂肪酸的測(cè)定

測(cè)定培養(yǎng)基上清的甘油含量，發(fā)現(xiàn)甘油含量明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05 ）。脂肪酸的含量無(wú)變化，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05 ）。見(jiàn)圖1。

3 討論

糖脂代謝的異常形成和加重了糖尿病胰島素抵抗。葡萄糖進(jìn)入脂肪組織可以轉(zhuǎn)化為甘油三酯，而脂肪組織可釋放游離脂肪酸參加氧化供能。因此，游離脂肪酸、甘油三酯、葡萄糖構(gòu)成極其復(fù)雜的能量代謝網(wǎng)絡(luò)，這一網(wǎng)絡(luò)的某些環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題將導(dǎo)致肥胖、胰島素抵抗、糖尿病、血脂紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、泡沫細(xì)胞形成等病理變化[3]。迄今為止，在哺乳動(dòng)物體內(nèi)共發(fā)現(xiàn)13種水通道蛋白亞型[4]。脂肪組織只表達(dá)AQP7，尤其是在內(nèi)臟脂肪組織[5]。該課題組[6]利用只在成熟脂肪細(xì)胞表達(dá)的aP2基因，將其與AQP 7cDNA連接，轉(zhuǎn)入在脂肪組織內(nèi)并特異性高表達(dá)，與對(duì)照組比較，試驗(yàn)組的AQP7mRNA和AQP7蛋白的表達(dá)明顯增加。高表達(dá)AQP7的3T3脂肪細(xì)胞株的培養(yǎng)基中，甘油含量明顯高于對(duì)照組，亦進(jìn)一步證明，AQP7蛋白的表達(dá)增加可促進(jìn)甘油向脂肪細(xì)胞外進(jìn)行排泄，為肥大的脂肪細(xì)胞減負(fù)[7]。在該實(shí)驗(yàn)中，脂肪酸的含量無(wú)變化。MaedaN 等[8]對(duì)AQP7缺陷小鼠血漿中的甘油測(cè)定發(fā)現(xiàn)，其濃度明顯降低，但游離脂肪酸的濃度無(wú)顯著變化，這說(shuō)明脂肪細(xì)胞膜上的AQP7只選擇性介導(dǎo)了甘油從細(xì)胞中的釋放而不運(yùn)輸脂肪酸。這將利于維持組織液和血漿中中的游離脂肪酸穩(wěn)定，不僅限制了脂肪酸的再次酯化，而且也防止了高游離脂肪酸水平抑制葡萄糖氧化，加重胰島素抵抗[9]，加重肥胖。

綜上所述，構(gòu)建的含有ap2-AQP7的脂肪細(xì)胞可高表達(dá)的AQP7mRNA和AQP7蛋白，脂肪細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)的AQP7可顯著減少了脂肪細(xì)胞內(nèi)的甘油含量，將甘油向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而縮小了脂肪細(xì)胞的體積，同時(shí)游離脂肪酸的水平的穩(wěn)定，不加重胰島素抵抗所帶來(lái)的對(duì)機(jī)體的損壞。

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（收稿日期：2017-10-24）