片狀載體固定化胰蛋白酶的研究

黃冬麗，何云富，何亞濤，丁功濤

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730124）

0 引言

固定化酶技術(shù)近年來(lái)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品加工等領(lǐng)域，由于其具有利用率高、酶活性好、節(jié)約資源等優(yōu)勢(shì)，因此成為研究的熱點(diǎn)。胰蛋白酶來(lái)源于動(dòng)物的胰臟，一般用于消化細(xì)胞間的軟組織。當(dāng)其水解蛋白質(zhì)時(shí)，作用于與賴(lài)氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，細(xì)胞間黏蛋白和糖蛋白被除去，影響細(xì)胞骨架，使細(xì)胞分離[1]，在醫(yī)藥、食品工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用[2]。由于胰蛋白酶在水溶液中會(huì)發(fā)生自身消化反應(yīng)，存在利用率不高、無(wú)法回收利用、工業(yè)生產(chǎn)上成本高等問(wèn)題，因此常采用固定化技術(shù)對(duì)胰蛋白酶進(jìn)行固定化，提高了胰蛋白酶的利用率[3]。

戊二醛作為片狀載體與胰蛋白酶固定化反應(yīng)體系中的交聯(lián)劑，具有2個(gè)反應(yīng)性活性醛基，可與胰蛋白酶分子中的氨基酸殘基和片狀載體上暴露的活性位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生穩(wěn)定的交聯(lián)橋，從而在反應(yīng)中達(dá)到胰蛋白酶固定化的目的。片狀載體是由高分子材料聚丙烯合成的紙片狀載體，用于動(dòng)物細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，半懸浮培養(yǎng)的載體，其內(nèi)部含有網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，也便于在戊二醛處理后與胰蛋白酶發(fā)生交聯(lián)。張黎明等人[4]采用殼聚糖固定化胰蛋白酶，提高了胰蛋白酶的利用率，但固定化載體難回收。與傳統(tǒng)的固定化材料相比，片狀載體不僅提高了酶的利用率，還具有易回收的優(yōu)點(diǎn)[5]，在生產(chǎn)中可以節(jié)約成本。由于其突出的優(yōu)勢(shì)，因此在今后的實(shí)際生產(chǎn)中具有更加廣泛的應(yīng)用前景。試驗(yàn)主要對(duì)胰蛋白酶的固定化時(shí)間、固定化溫度、固定化pH值和固定化胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行初步探討，并對(duì)固定化效果進(jìn)行評(píng)估，希望為以后的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

胰蛋白酶、片狀載體，民海生物有限公司提供；氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、體積分?jǐn)?shù)為38%的鹽酸溶液、體積分?jǐn)?shù)為20%的戊二醛溶液、硫酸銨，煙臺(tái)市雙雙化工有限公司提供；氫氧化鈉、無(wú)水乙醇、硫酸銨，均為分析純。

1.2 主要儀器

Biomate 5型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海智成有限公司產(chǎn)品；ISS-4075型立式水平搖床，上海沉匯儀器有限公司產(chǎn)品；MT90型磁力攪拌器，溫州邁騰機(jī)械科技有限公司產(chǎn)品；MP120-BLE型便攜式酸度計(jì)，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 固定化活性載體的預(yù)處理

準(zhǔn)確稱(chēng)取試驗(yàn)組片狀載體5.00 g，先分別加入到磨砂口三角瓶中，再加入小號(hào)磁性轉(zhuǎn)子，最后加入20 mL 70%乙醇，20 mL 0.5 mol/L的硫酸銨溶液，20 mL 4%HCl溶液，20 mL 4%NaOH溶液，加蓋，置于溫度15℃的磁力攪拌器中，設(shè)置轉(zhuǎn)速100 r/min，時(shí)間30 min，啟動(dòng)攪拌器，待結(jié)束后將載體用蒸餾水水洗至中性，取出磁性轉(zhuǎn)子。

1.3.2 胰蛋白酶的固定化

紫外分光光度計(jì)測(cè)定不同濃度胰蛋白酶溶液的吸光度，設(shè)置吸收波長(zhǎng)為280 nm，吸光度為0.2～0.8，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到方程，R2≥0.9判定為可信。

稱(chēng)取經(jīng)預(yù)處理的片狀載體，分別加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的胰蛋白酶溶液，0.3%的戊二醛溶液，加蓋，置于水平搖床上，設(shè)置轉(zhuǎn)速、時(shí)間、溫度、pH值，結(jié)束后取出載體，將濾液轉(zhuǎn)移到試管中，并放在4℃冰箱中靜置1 h，取上清液測(cè)吸光度[6]，以吸光度計(jì)算固定化載量。

1.3.3 酶活力的測(cè)定

測(cè)定胰蛋白酶活力可以采用Folin法[7]。具體方法如下：加入2%的卵清白質(zhì)作為底物，然后加入一定量的胰蛋白酶液，在溫度35℃，pH值8的條件下恒溫振蕩10 min，終止反應(yīng)后抽取濾液用Folin試劑顯色，于波長(zhǎng)680 nm處測(cè)定吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 交聯(lián)劑濃度對(duì)固定化酶載量及活力回收率的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)戊二醛對(duì)固定化酶活力回收率的影響見(jiàn)圖1。

圖1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)戊二醛對(duì)固定化酶活力回收率的影響

由圖1可知，酶活力回收率隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而逐漸下降。在質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%之前，酶活力回收率隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加下降的較慢；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%之后，由于戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高，抑制了酶的活性，導(dǎo)致酶活力下降，故在戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%之后，酶活力回收率下降明顯[8]。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛對(duì)酶固定化載量的影響見(jiàn)表1。

由表1可知，酶的固定化載量隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增加。在戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%之前，酶的固定化載量隨戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高增加明顯，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到0.3%以后，酶的固定化載量基本不再增加。

結(jié)果表明，0.3%戊二醛和0.4%戊二醛作為交聯(lián)劑對(duì)固定化載量影響差異不顯著，對(duì)固定化酶活力回收率影響差異顯著。在研究中可以確定固定化反應(yīng)體系中最佳戊二醛質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。

表1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的戊二醛對(duì)酶固定化載量的影響

2.2 胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)固定化率的影響

在固定化溫度35℃，固定化pH值8.0，固定化時(shí)間3 h，取相同量的載體5.00 g，只改變胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，分別制備固定化胰蛋白酶。

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)胰蛋白酶對(duì)固定化率的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)胰蛋白酶對(duì)固定化率的影響

由圖2可知，在胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2.0%時(shí)，此時(shí)酶的固定化率最高。相同質(zhì)量的片狀載體加入不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的胰蛋白酶，固定化率隨著胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)的升高而增加。由于片狀載體可固定的胰蛋白酶的酶量是有限的，在胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加到一定量之后，片狀載體對(duì)胰蛋白酶的固定化量已接近飽和，固定化率達(dá)到最高；此后，再增加酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)，固定化率基本不再變化[9]。結(jié)果表明，胰蛋白酶在質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時(shí)固定化率最高，在研究中可以確定反應(yīng)體系中胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到2%時(shí)固定化效果最好。

2.3 不同固定化時(shí)間對(duì)固定化率的影響

在固定化溫度35℃，固定化pH值8.0，胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，取相同量的載體5.00 g，只改變固定化時(shí)間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，分別制備固定化胰蛋白酶。

不同固定化時(shí)間對(duì)固定化率的影響見(jiàn)圖3。

圖3 不同固定化時(shí)間對(duì)固定化率的影響

由圖3可知，在固定化時(shí)間為1.5 h時(shí)，酶的固定化率最高。片狀載體內(nèi)部有網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)，具有較大的比表面積。在反應(yīng)的開(kāi)始階段，胰蛋白酶的固定化速率較快，故固定化率隨著固定化時(shí)間的增加而升高較快；隨著固定化時(shí)間增加到1.0～1.5 h，固定化量逐漸達(dá)到飽和，此時(shí)固定化率的增長(zhǎng)速度放緩；在固定化達(dá)到1.5h后，片狀載體對(duì)胰蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的固定化量已經(jīng)達(dá)到飽和，此后再增加固定化時(shí)間，對(duì)酶的固定化率影響不大[10]。結(jié)果表明，固定化時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)固定化率最高，在研究中可以確定反應(yīng)體系中固定化時(shí)間達(dá)到1.5 h時(shí)固定化效果最好。

2.4 不同固定化溫度對(duì)固定化率的影響

在固定化pH值8.0，胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，固定化時(shí)間3 h，取相同量的載體5.00 g，只改變固定化溫度25，30，35，40，45，50℃，分別制備固定化胰蛋白酶。

不同固定化溫度對(duì)固定化率的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同固定化溫度對(duì)固定化率的影響

由圖4可知，在固定化溫度達(dá)到40℃時(shí)，固定化率最高。溫度對(duì)固定化率的影響主要通過(guò)影響酶的活力來(lái)調(diào)節(jié)。當(dāng)固定化溫度較低時(shí)，酶的活力受到抑制，此時(shí)酶的固定化率較低；隨著固定化溫度的上升，酶的活力增加，故酶的固定化率升高；在達(dá)到酶的最適溫度時(shí)，酶的固定化率最高；此后再升高固定化溫度，反而會(huì)抑制酶的活性，導(dǎo)致酶的固定化率下降[11]。結(jié)果表明，固定化溫度達(dá)到40℃時(shí)固定化率最高，在研究中可以確定反應(yīng)體系中固定化溫度達(dá)到40℃時(shí)固定化效果最好。

2.5 不同固定化pH值對(duì)固定化率的影響

在固定化溫度35℃，胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%，固定化時(shí)間3 h，取相同量的載體5.00 g，只改變固定化pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，分別制備固定化胰蛋白酶。

固定化pH值對(duì)固定化率的影響見(jiàn)圖5。

圖5 固定化pH值對(duì)固定化率的影響

由圖5可知，在固定化pH值達(dá)到8.0時(shí)，固定化率最高。固定化pH值對(duì)固定化率的影響主要通過(guò)影響酶的活力來(lái)調(diào)節(jié)。當(dāng)固定化pH值較低時(shí)，酶的活力受到抑制，此時(shí)酶的固定化率較低；隨著固定化pH值的上升，酶的活力增加，故酶的固定化率升高；在達(dá)到酶作用的最適pH值時(shí)，酶的固定化率最高；此后pH值再增加，反而會(huì)抑制酶的活性，導(dǎo)致酶的固定化率下降[12]。結(jié)果表明，固定化pH值達(dá)到8時(shí)固定化率最高，在研究中可以確定反應(yīng)體系中固定化pH值達(dá)到8.0時(shí)固定化效果最好。

3 結(jié)論

固定化溫度，固定化pH值，固定化時(shí)間和胰蛋白酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)都是影響胰蛋白酶固定化率的重要因素，通過(guò)控制這些固定化條件，同時(shí)選用合適的固定化載體，在溫和的反應(yīng)條件下，可成功地制備性能優(yōu)良的固定化胰蛋白酶。

目前常采用的固定化材料有纖維素球、殼聚糖和磁納米材料，然而，試驗(yàn)所選用的固定化材料為片狀載體。與傳統(tǒng)的固定化材料相比，片狀載體具有成本低、操作簡(jiǎn)單、易回收、固定化率高等優(yōu)點(diǎn)。

同時(shí)固定化酶也解決了游離酶穩(wěn)定性低、易降解、難回收的缺點(diǎn)，為生產(chǎn)簡(jiǎn)化了操作，節(jié)約了成本，也為以后關(guān)于固定化酶的研究提供了參考。