中風通脈湯調控miR-155治療急性腦梗死的作用機制研究

趙平麗，秦合偉，呂哲

(1.駐馬店市中醫院，河南 駐馬店 463000；2.河南省中醫院/河南中醫藥大學第二附屬醫院，河南 鄭州 450000)

急性腦梗死是臨床上最常見的缺血性心腦血管疾病之一，研究發現微小RNA(miRNA)在急性腦梗死發病機制中起到重要作用[1]，微小RNA-155(miR-155)在固有免疫和適應性免疫中發揮作用，參與了急性腦梗死的發生和調控，研究發現，miR-155對Treg增殖具有調控作用，其異常表達與免疫穩態異常引發的疾病相關[2]。本研究觀察中風通脈湯對miR-155調控及對調節性T細胞(Treg)表達水平的影響，研究中風通脈湯治療急性腦梗死的作用機制，現論述如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料

選取2015年5月—2017年5月駐馬店市中醫院收治的確診為急性腦梗死的80例患者，按照隨機數字表法將80例患者分為觀察組和對照組，每組各40例，觀察組男性患者20例，女性患者20例；年齡40～69歲，平均(48.89±6.55)歲，發病時間(15.78±3.79)h；對照組40例，男性患者21例，女性患者19例；年齡41～70歲，平均(49.01±7.46)歲，發病時間(16.04±6.35)h；兩組患者在年齡、性別和發病時間等方面比較差異無統計學意義(P>0.05)。

1.2 西醫診斷標準

(1)西醫診斷符合中華醫學會第四次腦血管病學術會議制定的急性腦梗死診斷標準[3]；(2)患者發病時間6～72 h；(3)安靜狀態下發病，發病時多數無顯著頭痛及嘔吐，經過頭顱MRI或者CT證實有梗死病灶，有明顯低密度改變。

1.3 中醫診斷標準

中醫證候診斷標準參照1996年國家中醫藥管理局腦病急癥科研協作組制訂的《中風病診斷療效評定標準》氣虛血瘀證,證見半身不遂，口舌歪斜，言語謇澀或不語，偏身麻木，面色蒼白，氣短乏力，口角流涎，自汗心悸，手足腫脹，舌質暗淡，舌苔薄白或白膩，脈沉緩或沉澀[4]。

1.4 納入標準

(1)符合上述中醫診斷標準和西醫診斷標準；(2)經倫理委員會審查通過，患者或家屬簽署知情同意書。

1.5 排除標準

(1)大面積腦梗死生命體征不穩定者；(2)伴有嚴重的心、肝、肺、腎等原發病患者；(3)妊娠或哺乳期者；(4)不能配合本研究和治療的患者。

1.6 治療方法

對照組：采用抗凝、抗血小板、改善循環、營養神經、調節血脂、清除自由基和調控血壓血糖等常規基礎療法[5]。

觀察組：在基礎治療同時服用中風通脈湯，中風通脈湯組成：黃芪30 g，黨參15 g，當歸尾10 g，赤芍15 g，紅花10 g，川芎10 g，桃仁10 g，地龍10 g，水蛭12 g，甘草 g，每付煎成2包，每包煎成150 mL，口服或鼻飼，每次150 mL，每日2次，2周為一療程。兩組均治療2周后進行療效評價。

1.7 觀察指標

(1)外周血調節性T細胞(Treg)表達水平測定：采用流式細胞儀Facscalibur檢測，儀器及試劑盒購自美國BD公司，采用CellQuest Pro軟件進行分析[6]。

(2)采用熒光RT-PCR法檢測miR-155和Foxp3 mRNA水平：抽取靜脈血10 mL，肝素抗凝，采用TRIzol一步法提取總RNA，β-actin為內參物。各基因引物序列及擴增產物長度：

miR-155上游引物5′-CGTTAATGCTAATCGTGATAG3′，下游引物5′-GCAGGGTCCGAGGT3′；Foxp3上游引物5′-CCTGGGCTCCTCGCCTCACC3′，下游引物5′-TCTCTCTGCCCCTCACC3′；β-actin，上游引物5′-GTAAAGACCTCTATGCCA3′，下游引物5′-CCTTCACCGTCCAGTTT-3′。

(3)采用ELISA法檢測血清炎性因子水平：白介素-10(IL-10)、腫瘤壞死因子(TNF-α)、白介素-6(IL-6)[1]。

(4)檢測血漿同型半胱氨酸(HCY)、血管性假血友病因子(VWF)和a顆粒膜蛋白-140(GMP-140)等血栓相關因子水平：清晨采集空腹靜脈血，離心分離血漿進行測定[7]。

(5)采用美國國立衛生研究院卒中量表(NIHSS)評定患者神經功能[8]，采用Barthel指數(Barthel index，BI)積分法評定日常生活能力。

(6)臨床總療效：根據NIHSS評分減少百分比進行評定：①基本痊愈：91%～100%;②顯著進步：46%～90%級;③進步：18%～45%;④無效：小于17%，每組總有效率=(基本痊愈例數+顯著進步例數+進步例數)/總例數[8]。

(7)并發癥監測：治療期間檢測患者血、尿、大便常規及肝、腎功能。

1.8 統計學處理

所得數據采用SPSS18.0統計學軟件進行分析，計量資料采用(均數±標準差)表示，以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 中風通脈湯對外周血Treg表達率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表達的影響

治療前，兩組患者Treg表達率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表達水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者Treg表達率、FoxP3 mRNA、miR-155 mRNA表達水平較治療前明顯降低(P<0. 05)，觀察組患者降低程度明顯大于對照組(P<0. 05),見表1。

表1 中風通脈湯對外周血Treg表達率，FoxP3 mRNA，miR-155 mRNA表達的影響

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.2 中風通脈湯對血清IL-10、TNF-α、IL-6水平的影響

治療前，觀察組和對照組的血清IL-10、TNF-α、IL-6水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者血清IL-10、TNF-α、IL-6水平較治療前均明顯降低(P<0.05)，且觀察組的降低程度大于對照組(P<0.05)。具體見表2。

表2 中風通脈湯對血清IL-10、TNF-α、IL-6水平的影響

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.3 中風通脈湯對Hcy、VWF和GMP-140等血栓相關因子水平的影響

治療前，兩組患者間血漿Hcy、VWF和GMP-140等血栓相關因子水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者血漿Hcy、VWF和GMP-140水平均明顯降低(P<0.05)，且觀察組的改善程度優于對照組(P<0.05)。見表3。

表3 中風通脈湯對Hcy、VWF和GMP-140等血栓相關因子水平的影響

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.4 兩組患者NIHSS積分和BI積分比較

治療前，兩組患者間NIHSS積分和BI積分比較差異無統計學意義(P>0.05)；治療后，兩組患者NIHSS積分和BI積分較治療前明顯改善(P<0.05)；觀察組NIHSS評分和BI積分改善程度優于對照組(P<0.05)。見表4。

表4 兩組患者間NIHSS積分和BI積分比較分)

注：與本組治療前比較，*P<0.05；與對照組治療后比較，▲P<0.05

2.5 兩組患者臨床總有效率比較

觀察組患者總有效率96.00%明顯優于對照組86.00%(P<0.05)。見表5。

表5 兩組患者臨床總有效率比較[例(%)]

注：與對照組比較，*P<0.05

2.6 并發癥監測

治療期間未發現血、尿、大便常規及肝、腎功能異常。

3 討論

急性腦梗死是由于腦血管閉塞引起的顱內相應供血部位的腦組織缺血缺氧性壞死，進而引起患者肢體功能障礙，研究發現，急性腦梗死與炎癥反應密切相關，血清TNF-α水平與腦梗死的面積大小成正比，IL-10和IL-6在動脈粥樣硬化和腦梗死繼發腦損傷發生中具有重要意義[9-10]。研究發現，急性腦梗死可能處于免疫反應亢進，免疫抑制和促炎、抗炎反應的動態演變之中，急性腦梗死患者外周血Treg，FoxP3 mRNA表達及相關因子血清IL-10、TNF-α、IL-6水平顯著高于正常人，miR-155調控急性炎癥和Treg增殖的雙重作用，起到一定的免疫抑制作用，miR-155表達增加促使機體炎癥反應，效應性T細胞和特異性抗體的產生，在特異性免疫和固有免疫中起到關鍵性作用，參與了急性腦梗死的炎性反應，FoxP3是Treg最關鍵及特異性的轉錄因子，能夠結合在體內miR-155的mRNA的一個內含子上，并分泌多功能的細胞因子IL-10，其能夠抑制趨化因子及炎癥因子TNF-α、IL-6的產生，是一個具有獨特免疫調節功能及誘導免疫耐受的T細胞亞群，由此可見，miR-155是急性腦梗死患者免疫失調的調控網絡中的一個位點[6]。

研究發現，同型半胱氨酸(HCY)代謝異常能夠直接損害血管內皮細胞功能，導致膽固醇以及脂蛋白在血管壁沉積，促進動脈粥樣硬化和血栓的形成[11]。研究發現，血漿血管性假血友病因子(VWF)水平與血管內皮細胞受損以及血小板黏附性密切相關，血漿a顆粒膜蛋白-140(GMP-140)是血栓前狀態和血栓形成的標志物，VWF和GMP-140均在凝血反應中起重要作用[12]。

腦梗死在中醫學中屬“中風”范疇，患者多因正氣虧虛，復因勞欲過度陰陽失調、氣血逆亂，產生風、火、痰、瘀，上犯于腦，腦脈痹阻，病機氣虛為本，瘀阻為標，氣血運行不利，導致腦脈痹阻，以氣虛血瘀為主要證型。中風通脈湯由補陽還五湯加減化裁而來，經過腦病科多年的臨床實踐證實療效可靠，是本院治療急性腦梗死的主要方劑，中風通脈湯方中重用黃芪和黨參補氣，當歸尾和赤芍活血祛瘀通絡，川芎性味辛溫，能活血行氣，祛風止痛，桃仁破血祛瘀，紅花活血通經，祛瘀止痛，地龍和水蛭破血通絡除痹，甘草調和諸藥。諸藥共奏補氣扶正、溫經化瘀、消栓通絡之功。

本研究觀察中風通脈湯對氣虛血瘀型急性腦梗死患者的臨床療效，并研究其作用機制。結果顯示，經中風通脈湯治療后，觀察組患者miR-155、Foxp3 mRNA表達水平和IL-10、TNF-α、IL-6水平較治療前和對照組治療后明顯降低，Hcy、VWF和GMP-140血栓相關因子水平較治療前和對照組治療后明顯降低，患者NIHSS積分和BI積分較治療前明顯改善，觀察組臨床總有效率明顯優于對照組。研究結果表明，中風通脈湯治療氣虛血瘀型急性腦梗死，能夠改善血清炎性因子水平，降低血栓相關因子水平，減輕腦組織損傷和神經功能缺損；這可能與其通過調控miR-155，進而調節Treg增殖，降低IL-10、TNF-α、IL-6水平有關，本研究為中醫藥治療急性腦梗死患者的作用機制研究提供了一定的依據。