文蛤寡肽對高脂飲食誘導小鼠腎損傷的修護作用

王佳佳，葉 蕾，楊最素*，余方苗，丁國芳

（浙江海洋大學食品與醫(yī)藥學院，浙江省海洋生物醫(yī)用制品工程技術研究中心，浙江 舟山 316022）

文蛤（Meretrix meretrix）俗稱蛤蜊，屬于軟體動物門、真瓣鰓目、簾蛤科、文蛤屬，是我國灘涂傳統(tǒng)養(yǎng)殖的主要貝類之一[1]。主要產(chǎn)于遼寧、山東、河北、江蘇沿海，盛產(chǎn)期為5、6月。文蛤不僅有“天下第一鮮”之稱，含有人體必需的氨基酸、蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素和其他重要物質(zhì)[2]，而且近年來關于文蛤中多糖、多肽、甾醇化合物、牛磺酸等物質(zhì)的活性研究較多，發(fā)現(xiàn)文蛤在抗癌、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、降糖、降血脂等方面具有良好的功效，為臨床治療或輔助治療各種疾病提供了理論依據(jù)[3]。研究發(fā)現(xiàn)文蛤中含有腫瘤抑制因子和促進因子，經(jīng)一系列方法得到的腫瘤抑制因子對小鼠S180肉瘤有顯著的抑制作用，對正常小鼠沒有毒性，遂將該物質(zhì)命名“蛤素”（mercenene），發(fā)現(xiàn)其可能是分子質(zhì)量小于10 kDa的多肽，且對體外HeLa細胞也具有較強抑制作用[4-5]。范成成[6]從文蛤中提取出兩種多肽Mer2和Mer1，Mer2對肝癌HepG2細胞具有很強的抑制作用，Mer1則能降低細胞內(nèi)黑色素的含量和酪氨酸酶的活性，具有抗氧化活性。王惠[1]從文蛤中提取出一種抗腫瘤多肽Mere15，發(fā)現(xiàn)其可以抑制MMPs的分泌和表達，并抑制細胞黏附、遷移、侵襲，對肺癌A549細胞具有良好的抑制作用。張綿松[7]進行了酶法制備文蛤血管緊張素轉換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）抑制肽的研究，發(fā)現(xiàn)當?shù)鞍缀繛? mg/mL時，ACE抑制率高達65.87%。本實驗室前期研究表明，文蛤內(nèi)臟經(jīng)酶解獲得的分子質(zhì)量為674.6 Da，氨基酸序列為Gln-Leu-Asn-Trp-Asp的文蛤寡肽（Meretrix meretrix oligopeptides，MMO），能修復經(jīng)軟脂酸誘導的非酒精性脂肪肝細胞模型，顯著改善細胞線粒體能量代謝受阻情況，對四氯化碳誘導的小鼠急性肝損傷也具有修復作用[8-9]。高脂飲食不僅可以導致脂肪肝，高血脂引起的脂質(zhì)代謝異常也是慢性腎損傷的重要影響因素[10-11]，而文蛤寡肽是否對高脂血引起的腎損傷也有修復作用，目前鮮見報道。因此本實驗以高脂飼料建立小鼠慢性腎損傷模型，探索MMO對高脂飲食誘導的小鼠腎損傷的保護作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

動物用清潔級雄性ICR小鼠34 只，體質(zhì)量（20±2）g，購于浙江省實驗動物中心（動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2016-0001），飼養(yǎng)于浙江海洋大學動物房。

基礎飼料、高脂飼料（膽固醇2.5%、膽酸鈉0.5%、豬油10%、基礎飼料87%） 浙江省醫(yī)學科學院。

MMO（氨基酸序列：Gln-Leu-Asn-Trp-Asp，純度＞90%）為本實驗室自制；二甲苯、乙醇 國藥集團化學試劑有限公司；辛伐他汀 廣東彼迪藥業(yè)有限公司；多聚賴氨酸 美國Sigma公司；低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、甘油三酯（triglyceride，TG）、總膽固醇（total cholesterol，TC）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液 南京建成生物工程公司；α-平滑肌肌動蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、轉錄生長因子-β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）抗體 北京博奧森生物科技有限公司；山羊抗兔IgG/HRP聚合物（二抗） 北京中杉金橋生物技術有限公司；SP Rabbit HRP Kit（DAB）試劑盒 北京康為世紀生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

ALPHA1-4/Ldplus型冷凍干燥機 德國CHRIST公司；CF16RXⅡ型高速低溫離心機 日本日立公司；congent μScale超濾系統(tǒng) 德國默克密理博公司；752FC紫外分光光度計 上海光譜儀器有限公司；切片機RM2135、攤片機HI1210、烤片機H1220 德國Leica公司；光學顯微鏡、CCD-NC6051顯微攝像 日本OLYMPUS公司。

1.3 方法

1.3.1 文蛤寡肽的提取方法

參考文獻[9]的方法提取文蛤寡肽。

1.3.2 小鼠分組、造模及給藥

將34 只成年雄性ICR小鼠在飼養(yǎng)環(huán)境中適應性飼養(yǎng)120 h后隨機分為2 組，正常組小鼠（8 只）喂基礎飼料，其余小鼠（26 只）喂高脂飼料。20 d后，從正常組與高脂飼料模型組各取兩只小鼠，處死，取肝臟，包埋后HE染色進行病理學診斷，證實造模成功。造模成功后，將模型組小鼠24 只再隨機分為4 組，每組6 只，分別為模型組、辛伐他汀陽性藥物組、MMO低劑量組、MMO高劑量組。將各組小鼠灌胃給藥，陽性藥物組劑量為200 mg/kg mb，MMO低、高劑量組分別為50、250 mg/kg mb，正常組與模型組則給予等量蒸餾水。每天觀察動物特征、行為活動等，每周記錄體質(zhì)量3 次。給藥30 d，末次灌胃后禁食不禁水24 h，摘眼球取血，4 ℃、4 000 r/min離心10 min取血清，用于生化測定。快速取出腎臟觀察形態(tài)并稱質(zhì)量；一部分腎臟用4%多聚甲醛固定，用于HE染色；余下腎臟放入液氮中快速凍存，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 小鼠腎臟指數(shù)的計算

根據(jù)式（1）計算腎臟指數(shù)。

1.3.4 小鼠血清中各項生化指標的測定

摘眼球取血，4 ℃、4 000 r/min離心10 min取血清，按試劑盒說明書步驟進行LDL-C、HDL-C、TC、TG濃度的測定。

1.3.5 小鼠AI的計算

參考文獻[12]，按式（2）計算小鼠動脈粥樣硬化指數(shù)（atherosclerosis index，AI）。

式中：cTC、cHDL-C分別為TC、HDL-C的濃度/（mmol/L）。

1.3.6 小鼠腎組織勻漿液中各種生化指標的測定

參考文獻[13]，準確稱取小鼠腎臟組織，按1∶9（m/V）的比例加入0.9%的生理鹽水，制成10%的勻漿液，4 000 r/min離心10 min，取上清液進行GSH-Px、SOD活力及MDA含量的測定。

1.3.7 組織病理學HE染色觀察

參考文獻[14-15]，取小鼠腎臟1 cm3左右，立即放入4%多聚甲醛溶液，固定24 h后，常規(guī)石蠟包埋后，制備5 μm厚切片，按照HE染色順序，中性樹膠封片且光鏡下觀察腎組織病理變化。

1.3.8 免疫組化法檢測α-SMA、TGF-β1蛋白的表達

參考文獻[9]，將小鼠腎臟切片常規(guī)脫蠟至水；內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫作用10 min；微波爐抗原修復，冷卻后磷酸鹽緩沖液洗滌2 次，每次5 min；滴加封閉用正常山羊血清工作液，室溫作用20 min，甩去多余液體；分別滴加適量稀釋的一抗（1∶300），4 ℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液洗3 次，每次5 min；滴加二抗，室溫孵育20 min；滴加適量HRP標記的鏈霉親和素，室溫孵育20 min；DAB顯色，鏡下控制時間，自來水沖洗；蘇木素復染5 min，乙醇梯度脫水，二甲苯透明后中性樹膠封片。顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件分析處理，實驗結果以±s表示，采用單因素方差分析比較差異顯著性，且以P＜0.05表示差異有顯著性。

2 結果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量變化情況

灌胃給藥30 d后，小鼠體質(zhì)量變化如表1所示。與正常組相比，高脂飼料模型組體質(zhì)量顯著增加，增幅為68.08%（P＜0.05），陽性藥物組體質(zhì)量增加與正常組相差不大，增幅為45.99%，MMO劑量組體質(zhì)量增幅和模型組相比有所下降，且呈現(xiàn)劑量依賴性，其中MMO高劑量組增幅為48.74%（P＜0.05），與陽性藥物組小鼠體質(zhì)量增加差別不大。

表 1 MMO對小鼠體質(zhì)量的影響（n＝6）Table 1 Effect of MMO on body weight of mice (n= 6)

2.2 MMO對小鼠腎臟指數(shù)的影響

表 2 MMO對小鼠腎臟指數(shù)的影響（n＝6）Table 2 Effect of MMO on kidney index in mice (n= 6)

如表2所示，與正常組相比，模型組腎臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05），各藥物組與模型組相比較，腎臟指數(shù)有所下降，且以陽性藥物組與MMO高劑量組最為明顯，并與模型組呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）。說明MMO可降低高脂飲食小鼠腎臟指數(shù)。

2.3 MMO對小鼠血清LDL-C、HDL-C濃度的影響

表 3 MMO對小鼠血清LDL-C、HDL-C濃度的影響（n＝6）Table 3 Effect of MMO on serum LDL-C and HDL-C levels of mice (n= 6)

如表3所示，與正常組比較，模型組小鼠血清LDL-C濃度明顯上升，HDL-C濃度明顯下降，呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05）；MMO高劑量組LDL-C濃度與模型組相比，顯著降低（P＜0.05），陽性藥物組與MMO低劑量組LDL-C濃度與模型組相比有下降趨勢，無統(tǒng)計學意義；與模型組相比，陽性藥物組與MMO高劑量組HDL-C濃度則顯著升高（P＜0.05）；各組藥物對血清LDL-C、HDL-C作用大小比較：MMO低劑量組＜陽性藥物組＜MMO高劑量組。說明MMO可降低高脂飲食小鼠血清LDL-C濃度以及升高HDL-C濃度，且有一定的劑量相關性。

2.4 MMO對小鼠血清中TC、TG濃度的影響

如表4所示，模型組小鼠血清TC、TG濃度與正常組相比，顯著升高（P＜0.05），分別達到正常組的1.84 倍與1.66 倍；與模型組比較，各藥物組TC濃度均有所降低，但陽性藥物組與MMO高劑量組效果更為顯著（P＜0.05），其中MMO高劑量組TC濃度降低幅度達到38.19%；各藥物組TG濃度與模型組相比，均有下降趨勢，且以MMO高劑量組降幅最大，達到25.64%。說明MMO可降低高脂飲食小鼠血清TC、TG濃度，并且呈現(xiàn)一定的劑量相關性。

表 4 MMO對小鼠血清TC、TG濃度的影響（n＝6）Table 4 Effect of MMO on serum TC and TG levels of mice (n= 6)

2.5 MMO對小鼠AI的影響

表 5 MMO對小鼠AI的影響（n＝6）Table 5 Effect of MMO on serum AI of mice (n= 6)

如表5所示，模型組AI與正常組相比，顯著升高（P＜0.05），是正常組的5.08 倍，各藥物組與模型組相比，AI降低，并均呈現(xiàn)顯著性差異（P＜0.05），且以MMO高劑量組降低幅度最為明顯，達到67.27%，陽性藥物組次之，為61.82%。說明MMO可降低高脂飲食小鼠AI，且劑量越高效果越好。

2.6 MMO對高脂飲食小鼠腎組織勻漿GSH-Px、SOD活力及MDA含量的影響

表 6 MMO對小鼠腎組織勻漿GSH-Px、SOD活力及MDA含量的影響（n＝6）Table 6 Effect of MMO on GSH-Px and SOD activities and MDA content in kidney of mice (n= 6)

如表6所示，模型組GSH-Px、SOD活力分別為正常組的63%和53%，MDA含量是正常組的2.76 倍，差異顯著（P＜0.05）；各藥物組與模型組相比，GSH-Px、SOD活性均有所升高，MDA含量均有所降低，其中以陽性藥物組與MMO高劑量組作用較為明顯，MMO高劑量組GSH-Px、SOD活性分別為模型組1.49 倍和1.58 倍，MDA含量是模型組的52%。說明MMO可提高高脂飲食小鼠腎組織勻漿GSH-Px、SOD活力以及降低MDA含量，且呈現(xiàn)劑量相關性。

2.7 MMO對腎組織的病理學影響

圖 1 小鼠腎組織HE染色（×400）Fig. 1 HE stained kidney sections of mouse (× 400)

每組小鼠腎組織切片HE染色后光鏡下觀察，正常組中，腎小體由腎小囊包繞腎小球組成，形態(tài)學表現(xiàn)正常，管腔清晰，腎小管形態(tài)規(guī)則，無炎癥浸潤（圖1A）；模型組腎組織切面蒼白，系膜細胞與系膜基質(zhì)增生，腎小管結構不清晰并有明顯空泡變性損傷，周圍可見炎癥細胞浸潤（圖1B）；MMO低劑量組，系膜細胞與系膜基質(zhì)增生輕微抑制，腎小管空泡變性情況有所減輕，（圖1D）；陽性藥物組（圖1C）與MMO高劑量組（圖1E）腎小球形態(tài)與正常組差別不大，腎小管結構清晰且腎小管空泡變性抑制效果優(yōu)于MMO低劑量組，炎癥細胞浸潤減少。

2.8 α-SMA、TGF-β1蛋白的表達

2.8.1 腎組織α-SMA蛋白表達

圖 2 小鼠腎組織α-SMA表達情況（×400）Fig. 2 Protein expression of α-SMA in kidney tissue (× 400)

如圖2所示，α-SMA蛋白陽性表達為棕褐色，位于細胞質(zhì)。正常組僅有少量表達（圖2A）；模型組陽性部位大量表達于腎小管中，棕褐色顏色較深（圖2A）；MMO低劑量組（圖2D）陽性表達與模型組相比大量減少；MMO高劑量組（圖2E）α-SMA蛋白陽性表達部位比低劑量組更少，并與陽性藥物組（圖2C）差別不大。說明MMO可減少α-SMA在腎臟中的表達。

2.8.2 腎組織TGF-β1蛋白表達

圖 3 小鼠腎組織TGF-β1表達情況（×400）Fig. 3 Protein expression of TGF-β1 in kidney tissue (× 400)

免疫組化法顯示MMO對各組小鼠腎組織TGF-β1蛋白表達影響如圖3所示，TGF-β1蛋白陽性表達為棕黃色，位于細胞質(zhì)。正常組僅少量表達于腎小管中（圖3A）；模型組腎小管中大量表達，顏色較深（圖3B）；陽性藥物組少量表達（圖3C）；MMO低劑量組表達情況與模型組無太大差異，顏色稍淺（圖3D）；MMO高劑量組表達量比陽性藥物組更少，僅有個別細胞表達（圖3E）。

3 討 論

近年來，國內(nèi)外也有關于活性肽緩解腎毒性的報道。田穎剛等[16]發(fā)現(xiàn)絲羽烏骨雞活性肽能降低治療組小鼠血清尿素氮、血清肌肝的含量，使腎組織勻漿中MDA含量下降，SOD、GSH-Px活力增高，初步證實適量的羽烏骨雞活性肽對順鉑所致小鼠腎毒性具有很好的防護作用。孫青[17]以高脂飲食誘導高脂血癥大鼠，在整體、蛋白、細胞因子等各個水平上進行探討，發(fā)現(xiàn)大豆肽具有調(diào)節(jié)血脂代謝及抗動脈粥樣硬化的作用。由于海洋肽類藥物具有分子質(zhì)量小、結構簡單、副作用小、無免疫原性、活性高等優(yōu)點。因而，從海洋生物中提取護腎保腎活性物質(zhì)是開發(fā)藥源的重要途徑之一。Nasri等[18]對蝦虎魚蛋白水解物進行研究，發(fā)現(xiàn)其水解物可有效改善高脂飲食導致的大鼠腎損傷。趙海峰等[19]曾對海洋膠原肽對腺嘌呤所致的大鼠慢性腎損傷進行研究，以深海鮭魚的魚皮為主要原材料，生物酶法制備混合寡肽，灌胃小鼠。結果發(fā)現(xiàn)：海洋膠原肽干預組小鼠不同時間點中血清肌肝、尿素氮較模型組大鼠血清的相應指標明顯降低，而肌醉清除率則明顯高于模型組，超微結構的改變也較模型組減輕。

本研究按提取條件提取所需量的MMO，將小鼠分組、給藥。小鼠體質(zhì)量指標與腎臟指數(shù)指標顯示：模型組體質(zhì)量增幅明顯高于正常組與各藥物組，小鼠腎臟指數(shù)顯著升高；而各藥物組小鼠體質(zhì)量增幅下降，腎臟指數(shù)均低于模型組。由此說明造模較為成功，MMO可降低小鼠的腎臟指數(shù)。

有研究表明長期高脂飲食會使機體脂肪代謝異常，引起高脂血癥，其主要是以LDL-C、TC、TG含量的上升，HDL-C含量下降為主要特征[20]。高脂血使脂質(zhì)在腎臟沉積，直接損傷腎臟。人體中TC、TG主要在肝臟中合成，兩者的血清濃度反映出脂代謝的水平。HDL可將周圍組織TC運輸?shù)礁闻K，再轉化為膽汁酸或通過膽汁從腸道排出，所以HDL-C濃度與動脈管腔狹窄程度呈負相關。LDL可以將膽固醇從肝臟運輸至外周組織細胞，當其含量過高時，它所攜的TC便會在動脈壁堆積而引起動脈硬化，故而LDL-C濃度與動脈管腔狹窄程度呈正相關[21]。本實驗發(fā)現(xiàn)模型組小鼠TC、TG、LDL-C含量顯著升高，HDL-C含量下降，AI指數(shù)顯著升高，說明高脂飲食誘發(fā)高脂血癥，高血脂繼而損害全身動脈產(chǎn)生動脈粥樣硬化，而MMO可有效降低小鼠血清TC、TG、LDL-C含量，升高HDL-C含量，并降低AI指數(shù)，降幅達到67.27%。說明MMO可減輕高脂血癥。

很多研究發(fā)現(xiàn)氧化應激在腎損傷中也發(fā)揮著重要作用[22-23]。脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生活性氧，而過量活性氧會損傷細胞、組織，加重動脈粥樣硬化和腎病的發(fā)生，SOD與GSH-Px活力可以反映出機體抗氧化能力，MDA是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，多集中沉積于腎臟、肝臟、睪丸、心肌等組織細胞內(nèi)，能破壞細胞膜結構使細胞死亡，反應出機體受自由基損傷程度[24]。本實驗發(fā)現(xiàn)：模型組腎勻漿SOD與GSH-Px活力下降，與MDA含量增多相一致，MMO高劑量組GSH-Px、SOD活力與模型組相比，顯著升高（P＜0.05），MDA含量則顯著降低（P＜0.05），因此，MMO可提高小鼠腎臟抗氧化水平，減輕小鼠腎損傷。

脂代謝紊亂導致的脂質(zhì)沉積、腎臟系膜基質(zhì)增多、腎小球系膜擴張以及巨噬細胞增殖和聚集等最終可導致腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化[25]。本實驗通過HE染色，觀察MMO對腎臟病理學影響，高脂飼料組小鼠腎臟損傷嚴重，主要體現(xiàn)在腎組織切面蒼白，系膜細胞與系膜基質(zhì)增生，腎小管結構不清晰并有明顯空泡變性損傷，周圍可見炎癥細胞浸潤；MMO給藥組則明顯改善了腎臟受損情況，腎濁腫減輕，系膜細胞與系膜基質(zhì)增生有所抑制，腎小管空泡變性癥狀減輕，MMO高劑量組與陽性藥物組腎臟形態(tài)差別不大。

腎小管間質(zhì)纖維化是各種病因導致的慢性腎臟疾病的主要特征[26]。腎組織中α-SMA、TGF-β1的大量表達與腎間質(zhì)纖維化、腎小球硬化、腎功能喪失等有明顯的相關性[27]。有研究表明腎小管上皮細胞-間充質(zhì)轉化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）是腎小管間質(zhì)纖維化的重要機制之一[28-29]。即是指腎小管上皮細胞轉化為肌成纖維細胞（myofibro-blast，MF）、纖維細胞而失去上皮細胞的特性。這一過程涉及4 個關鍵步驟：1）上皮細胞失去極性和黏附特性；2）重新表達α-SMA。正常情況下上皮細胞表達的是角蛋白（cytokeratin，CK），在EMT過程中，CK表達降低，α-SMA及波形纖維蛋白作為間充質(zhì)細胞的標志表達量增多，結構蛋白重組成為MF；3）腎小管基底膜破裂；4）細胞遷移、侵襲力增強。MF進入間質(zhì)，細胞外基質(zhì)增多，形成腎小管間質(zhì)纖維化[30-31]。在EMT的調(diào)節(jié)因子中，TGF-β1被認為是最主要的促纖維化因子[32-33]，在腎小管和腎小球足細胞轉分化過程中發(fā)揮著重要作用[34]。有研究證實，腎小管上皮細胞在不同濃度TGF-β誘導下，逐漸喪失“鋪路石樣”狀態(tài)而轉變?yōu)槔w維細胞表型[35]。本實驗研究結果表明：高脂飼料組腎組織中α-SMA、TGF-β1表達量明顯增加，說明高脂飲食可誘導腎小管上皮細胞-間充質(zhì)的纖維化而引進慢性腎病變，而應用MMO后，α-SMA、TGF-β1的表達明顯下降，結合腎的HE染色結果，認為由于MMO組的腎損傷程度小于模型組，腎小管上皮細胞的間質(zhì)纖維化減輕，這是導致α-SMA和TGF-β1表達下降的原因。至于MMO通過何種信號途徑導致α-SMA和TGF-β1表達下降需要以后的實驗來進一步證實。

綜上所述，高脂飲食能引起高脂血癥，提高小鼠血清AI指數(shù)，降低腎臟抗氧化酶活性，使α-SMA、TGF-β1表達量增加，促進腎小管上皮細胞轉分化的發(fā)生；MMO則可改善小鼠高血脂癥狀，提高腎臟抗氧化水平，緩解腎小管間質(zhì)纖維化，從而保護腎臟免受損傷。