黃連須根浸提液對無機磷細菌的負化感效應*

王玉書 劉 海，2 李 佳 魏立本 彭麗媛 黃建國?

（1 西南大學資源環境學院，重慶 400716）

（2 貴州省農業科學院農業科技信息研究所，貴陽 550006）

黃連（Coptis chinensis）屬毛茛科多年生草本植物，是我國人工栽培的傳統大宗中藥材植物之一［1-2］。在黃連生長過程中，通過莖葉淋溶、根系分泌和殘株腐解等多種途徑向土壤生態系統釋放小檗堿（berberine）、黃連堿（coptisine）和甲基黃連堿（worenine）等多種化感物質，對土壤生態系統產生持續影響［3-4］。在黃連根系分泌物中，小檗堿含量最高，可達總分泌物的50%以上，且化感作用最強［5］。研究發現，黃連須根浸提液中的小檗堿影響隆線溞的泳動能力、趨光性和存活率；降低斜生柵藻和蛋白核小球藻的葉綠素和蛋白質含量，抑制其生長繁殖，并改變體內超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性［6-7］。此外，黃連根系分泌物還破壞種子細胞膜結構，抑制蠶豆、豌豆、綠豆、萵苣和白菜等多種作物的種子發芽，胚乳養分利用和幼苗生長，以及硝酸還原酶和根系活性等［8-9］。

重慶市石柱縣是我國黃連的主產區（超過全國的60%產量）。但是當地種植黃連后的土壤必須間隔2～3年才能再次種植，嚴重影響黃連的持續供應，其原因尚不明確。有研究表明，在種植黃連后的土壤中，磷鉀細菌、自生固氮菌、氨化細菌和硝化細菌等多種有益微生物數量和生物量大幅減少，螺桿菌屬等病原菌增多，微生物群落多樣性指數和均勻度指數降低，說明土壤微生物的固氮、溶磷、解鉀、促生等功能受到抑制［10-11］，原因可能與黃連根系分泌物對有益菌群的化感效應有關，但迄今為止研究甚少。

無機磷細菌（Inorganic phosphorus-dissolving bacteria, iPDB）聚集的根系周圍，能夠將難溶性無機磷轉化為植物能吸收的有效磷，是重要的土壤有益微生物［12-14］。黃連根系分泌物抑制有益微生物的新陳代謝和生長繁殖，直接影響土壤養分的有效含量，植物促生和抗生物質分泌，增加發生連作病害的風險，造成連作障礙。高通量測序表明，在黃連種植的供試土壤中，伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia Yabunchi）的相對豐度較高，故本研究將以該菌屬的3株iPDB作為有益菌的代表，通過固、液培養，測定黃連須根浸提液對其生長繁殖、氫離子和有機酸分泌，以及溶磷作用的影響，探討黃連根系分泌物對有益菌群的化感效應，為揭示黃連連作障礙的發生機理和減輕連作障礙提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：伯克霍爾德氏菌屬（Burkholderia Yabunchi）的3株iPDB（B05、B07和B09），從重慶市縉云山黃壤（106o20′E，29o49′N，pH 4.34）中分離獲得，保存于西南大學資源環境學院微生物實驗室。

固體培養基（g）：瓊脂20、葡萄糖10、磷酸三鈣2.5、(NH4)2SO40.5、NaCl 0.2、MgSO4·7H2O 0.1、KCl 0.2、酵母膏0.5、MnSO4·4H2O和FeSO4·7H2O 各0.002，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0，液體培養基不含瓊脂。

黃連須根：在重慶市石柱縣黃水鎮（108o30'E，30o15′N），田間采集新鮮黃連須根，小檗堿50.20 mg g-1（干基）。

1.2 研究方法

取保存菌株，固體培養72 h，無菌生理鹽水洗滌，配成103個ml-1的菌液。

取新鮮黃連須根，洗凈泥土，去離子水浸泡24 h（25±1℃），過濾，配制成每ml含0.1 g 原藥的黃連須根浸提液（Extracts from fibrous roots of Coptis chinensis，ERC），紫外線滅菌。

蒸汽滅菌（121℃，1.5大氣壓，30 min，下同）固體培養基。由于1000mgL-1ERC顯著抑制蠶豆、萵苣和白菜等幼苗生長［8-9］，故當培養基冷卻至45～50℃時，加入ERC使其濃度分別達到0（對照）、500（低）、1000（中）和2000 （高）mg L-1，相當于含小檗堿0、7.31、14.62和29.24 mg L-1。取10ml培養基于60 mm培養皿中，冷卻后在中央分別接種0.1 ml B05、B07和B09菌液，25±1℃暗培養7 d，測量菌落和透明圈直徑，計算溶磷指數［15］：

取100 ml液體培養基于250 ml三角瓶中，蒸汽滅菌，冷卻后加ERC形成濃度分別為0、500、1 000和2 000 mg L-1的處理，各接種1 mlB05、B07和B09菌液，于25±1 °C搖瓶（75 r min-1）暗培養120 h，重復5次。

在培養6、12、18、36、72、120 h，各吸取5 ml液體培養基用于后續實驗。首先，取200 μl培養液用XSP-6C顯微鏡（上海迪諾力泰公司）觀測并計數iPDB數量。然后，將剩余培養基10 000 r min-1離心10 min，用PHS—3C精密酸度計測定上清液pH，鉬藍比色法測定無機磷含量［16］，計算溶磷量（培養液無機磷含量－對照培養液無機磷含量）×培養液體積［17］。培養結束后用0.1 mol L-1HCl酸化培養液，日立公司生產的D-7000高效液相色譜儀測定有機酸濃度。色譜條件為：L-7455二級管陣列檢測器，RezexRoa-Organic Acid300離子交換柱（美國Phenomenex公司生產），進樣量20 μl，流動相2.5 mmol L-1H2SO4，流速0.5 ml min-1，柱溫35℃，壓力 450 psi，Diode Array L-7455紫外檢測器，檢測波長210 nm。所檢測的有機酸包括草酸、檸檬酸、蘋果酸、丁二酸和乙酸，出峰時間依次為11.60、13.73、16.05、19.47和23.92 min。

1.3 數據處理

分別用 E x c e l 2 0 1 0、S P S S 1 7.0 和SigmaPlot12.5軟件對試驗數據進行基本計算、統計分析和作圖，采用LSD進行多重比較，顯著水平為p≤0.05。

2 結 果

2.1 ERC對iPDB生長和溶磷的影響

由圖1和表1可知，在固體培養時，ERC顯著降低B07和B09的菌落直徑、溶磷圈直徑和溶磷指數，濃度越高，降幅越大；盡管低、中濃度的ERC對 B07的生長和溶磷參數無顯著影響，但高濃度仍表現出抑制作用。在高濃度的ERC培養基中，透明圈直徑、菌落圈直徑和溶磷指數的最大降幅依次為51.01%～61.17%、48.51%～66.38%和9.15%～20.77%。此外，在含ERC的培養液中，溶磷量的降幅B09＞B07＞B05。

圖1 不同濃度ERC固體培養基iPDB的生長和溶磷狀況Fig. 1 Growth of iPDB and phosphorus dissolution in the solid culture medium relative to ERC concentration

表1 固體培養時ERC對iPDB生長和溶磷的影響Table 1 Effects of ERC on iPDB growth and phosphorus dissolution in the solid culture medium

圖2可見，在培養液中，iPDB生長對ERC的敏感性因菌株不同而異，在培養液中的平均數量變化于15.26×108ml-1（B05）～30.15×108ml-1（B07）。低、中濃度的ERC對B05生長無顯著影響，高濃度則抑制生長；低濃度ERC對B07生長無抑制作用，中、高濃度表現出抑制現象；B09數量隨ERC濃度提高而降低，最大降幅為52.98%。

圖2 在不同濃度的ERC培養液中iPDB的數量變化Fig. 2 Variation of the population of iPDB in the liquid culture medium relative to ERC concentration

2.2 ERC對iPDB分泌有機酸和氫離子的影響

在液體培養時，ERC對iPDB分泌有機酸和氫離子的影響見表2。

草酸：B09分泌草酸最多，平均濃度分別是B05和B07的1.72倍和2.21倍。隨ERC濃度提高，iPDB分泌草酸速率顯著降低，最大降幅依次為31.12%（B05）、73.37%（B07）和40.20%（B09）。

檸檬酸：ERC濃度越高，B07和B09分泌檸檬酸速率越低；但低濃度的ERC對B05分泌檸檬酸無顯著影響，中、高濃度則產生抑制作用。此外，檸檬酸分泌速率B07＞B05＞B09。

乙酸：在培養液中，B09不分泌乙酸。低、中濃度的ERC對B07分泌乙酸無顯著影響，但高濃度則降低分泌速率；但是，ERC對B05乙酸分泌無顯著影響。

蘋果酸：在B05和B07的培養液中，未檢測出蘋果酸。ERC濃度越高，B09培養液中蘋果酸含量越低，最大降幅較對照降低24.92%。

丁二酸：在供試菌株中，B05和B09不分泌丁二酸；B07的丁二酸分泌量隨ERC濃度增加而降低，較對照降低14.78%～51.61%。

氫離子：ERC濃度提高，B05、B07和B09分泌氫離子的速率持續降低。此外，培養液中的氫離子平均濃度（μg L-1）B07（331.18）＞B09（160.56）＞B05（11.34）。

2.3 ERC對iPDB溶磷量的影響

圖3可見，iPDB菌株不同，在培養液中的溶磷量也不一樣，平均值（m g L-1）分別為228.31±18.76（B05）、311.64±30.40（B07）和174.89±38.61（B09）。B05和B09的溶磷量（y）與培養時間（x）的關系可用y=x/(a+bx)描述，B07則可用y=y0＋a(1-e-bx)c反應。隨ERC濃度提高，B07和B09的溶磷量顯著降低。對B05而言，高濃度ERC抑制溶磷；培養時間≥72 h，低、中濃度ERC處理的溶磷量與對照無顯著差異。

2.4 有機酸和氫離子分泌與溶磷量的關系

相關分析表明，在B07和B09培養液中，溶磷量與氫離子濃度和有機酸分泌總量分別呈極顯著（p＜ 0.01）和顯著（p＜ 0.05）正相關；B05的溶磷量與氫離子和有機酸分泌總量的相關性均未達到顯著相關水平（表3）。但是，按3株iPDB進行統計，iPDB的溶磷量均與氫離子和有機酸分泌總量呈顯著正相關(r氫離子= 0.604*，r有機酸= 0.877**，n =12）。此外，iPDB的氫離子和有機酸分泌總量也呈顯著正相關（r= 0.598*，n = 12）。

3 討 論

黃連釋放的化感物質選擇性抑制植物、原生動物和微生物的生長繁殖［6］。前人研究發現，1 g L-1ERC（相當于小檗堿14.62 mg L-1）可抑制作物幼苗生長，顯著降低土壤微生物生物量、細菌數量和種群多樣性指數［8-11］。本研究表明，在固、液培養基中，盡管500 mg L-1的低濃度ERC對B05和B07的生長繁殖無顯著影響，但1 000、2 000 mg L-1濃度的ERC抑制iPDB生長。可見ERC對iPDB具有生物毒性。醫學研究表明，ERC對淋球菌（Neisseria gonorrhoeae）、白色念珠菌（Candida albicans）和肺炎克雷伯氏菌（klebsiella pneumoniae）等病原菌有抑制作用［18-19］。小檗堿是黃連的有效成分之一，能改變銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）膜脂流動性和膜蛋白構象，抑制其繁殖生長［20］；此外，小檗堿還能與副溶血菌（Vibrio parahaemolyticus）的核酸結合，抑制細胞膜蛋白合成，破壞細胞結構［21］。因此，在了解ERC抑制iPDB生長繁殖的基礎上，很有必要繼續研究有關機理。

表2 iPDB培養液中的有機酸和氫離子濃度Table 2 Concentrations of organic acids(mg L-1)and protons (μg L-1) in the iPDB culture solutions

圖3 不同濃度的ERC培養液中iPDB的溶磷量Fig. 3 Content of phosphorus dissolved by iPDB in the liquid culture medium relative toERC concentration

iPDB能夠有效參與土壤無機磷活化，提高土壤磷的生物有效性［22］。本研究表明，ERC抑制iPDB繁殖生長的同時，不同程度地降低其溶磷指數和溶磷量。由此可以推測，黃連生長過程中根系分泌物的釋放將抑制iPDB生長并進一步影響無機磷活化，由此產生連作障礙。

iPDB主要依賴分泌有機酸和氫離子活化土壤難溶性磷酸鹽［23］。供試菌株均能不同程度地分泌氫離子、草酸和檸檬酸和特異性分泌乙酸、蘋果酸和丁二酸，由此造成溶磷指數和溶磷量差異。由于iPDB主要分泌草酸和檸檬酸，而檸檬酸和草酸對Ca2＋、Fe3＋和Al3＋有極強的絡合效應（log K穩=7.26～25.00［24］），因而檸檬酸和草酸可能是土壤無機磷釋放的關鍵有機酸。此外，草酸和乙酸屬于較強的有機酸，能電離出大量的氫離子，促進難溶性磷酸鹽溶解［25］。從結果可以看出，iPDB的氫離子和有機酸分泌總量與溶磷量呈顯著正相關（r有機酸= 0.877**，r氫離子= 0.604*，n = 12）。推測iPDB溶磷圈減小，溶磷指數和溶磷量降低的原因可能與ERC抑制氫離子和有機酸分泌有關。

表3 有機酸和氫離子分泌及溶磷量之間的相關系數Table 3 Correlation coefficients of P dissolution with release of organic acids and protons

iPDB合成與分泌有機酸和氫離子的速率關系到培養液中的有機酸和氫離子含量。在iPDB培養液中加入ERC，不同程度地降低溶液有機酸和氫離子濃度，說明其合成與分泌可能受到抑制。在微生物糖代謝過程中，ERC抑制丙酮酸氧化，乙酰CoA生成減少，影響三羧酸循環（Tricarboxylic acid cycle, TCA）正常進行，直接涉及檸檬酸和乙酸的生物合成，它們同時也是草酸合成的直接（乙酸）和間接前體（檸檬酸）［19,25］。黃連富含小檗堿、黃連堿和巴馬汀等多種化感物質，其中小檗堿能與它們的主要靶點——膜蛋白發生非特異性結合，導致細胞膜的通透性改變，進而彌散進入細胞內，與細胞核膜上的磷脂結合，對細胞的毒性極強；小檗堿還抑制某些微生物的DNA復制、RNA轉錄、蛋白質和脂質的生物合成，影響有機酸合成酶的基因表達或活性［26-27］。此外，iPDB利用ATP提供的能量，通過質子泵將H+釋放到細胞膜外，ERC影響膜電子傳遞和ATP合成與分解等，可能降低H+分泌速率［28-29］。因此，ERC中的化感成分可能妨礙iPDB合成分泌有機酸和氫離子。

4 結 論

ERC對iPDB呈負化感效應，不同程度地抑制iPDB生長繁殖，有機酸和氫離子分泌，以及無機磷溶解。在種植黃連的土壤中，其根系分泌的化感物質可能影響iPDB的種群結構和功能，降低土壤無機磷的生物有效性，可視為發生連作障礙的潛在原因。