土壤厭氧消毒對青枯病的控制及土壤細菌群落結構的影響*

伍朝榮 林威鵬 黃 飛 蔡一霞 田紀輝 呂 順 Joji Muramoto Carol Shennan 蔡昆爭?

（1 華南農業大學資源環境學院，廣州 510642）

（2 廣西作物遺傳改良生物技術重點開放實驗室，南寧 530007）

（3 廣東省東莞市香蕉蔬菜研究所，廣東東莞 523061）

（4 加州大學Santa Cruz分校環境系，CA 95064，USA）

青枯病（Bacterial wilt）是一種由青枯菌（Ralstonia solanacearum）引起的毀滅性土傳病害。青枯菌作為一種好氧型細菌，最適生長溫度27～35℃，且不含內生孢子和莢膜［1］。它存在明顯的菌系差異，根據對不同寄主植物的致病性反應，可分為5個小種，有著廣泛的寄主，涉及54個科的450余種植物［2］，是世界上危害最大、分布最廣、造成損失最大的毀滅性土傳病害之一，威脅著熱帶和亞熱帶地區的農業生產［3-4］。目前，青枯病的防治主要包括抗病育種、物理防治、生物防治、化學防治、農業管理等，但效果仍不理想。

土壤消毒是一種高效快速殺滅土壤中真菌、細菌、雜草、土傳病毒、地下害蟲、嚙齒動物的技術，是防治設施農業土傳病蟲害最直接有效的方法之一，主要包括物理消毒、化學藥劑消毒和生物熏蒸消毒3大類。周雪青等［5］綜合比較了各種土壤消毒方法，認為蒸汽熏蒸技術為最理想的土壤消毒方法，無污染，對任何害蟲均有效，但成本太高。目前，化學藥劑消毒是使用最廣泛、最方便且最有效的方法，但是過度使用會輸入大量殘留化學物質，造成土壤及水體污染，危及農產品安全，不符合綠色食品和有機食品生產要求。

21世紀初，荷蘭［6-7］和日本［8］科學家提出了一種生態替代化學熏蒸控制土傳病害的有效方法——土壤厭氧消毒（Anaerobic soil disinfestation,ASD），也稱為生物土壤滅菌（Biological soil disinfestations, BSD)或強還原土壤滅菌（Reductive soil disinfestation, RSD)。該方法被應用于各種農作物的土傳病害防控，如香蕉、草莓、番茄、蘆筍等［9-10］。顧志光［11］和黃新琦［12］等分別運用添加有機物料并淹水來防治辣椒疫病和香蕉枯萎病等真菌性病害，伍朝榮等［13］添加有機物料并覆膜厭氧消毒防控細菌性病害番茄青枯病，均取得良好的防治效果。該方法的基本原理主要是通過向土壤添加易分解的有機碳源，然后灌水和覆膜形成厭氧環境，土壤微生物利用碳源產生大量對土傳病原菌有毒有害的分解產物，同時改變微生物群落結構等從而有效防控病蟲害。多數研究表明，碳源類型及添加量、土壤類型、溫度及處理時長均能直接影響消毒效果［14-15］。Hewavitharana等［16］對比研究了雜草和乙醇作為添加物料對土傳病害的影響，發現二者對腐霉屬和短體線蟲抑制效果無顯著差異，產生的揮發性有機化合物（VOC）的量也是同等數量級。Strauss和Kluepfe［17］認為添加量為低于20.2 t hm–2即可形成病菌致命環境，而碳源可以選擇當地農作物剩余物。Wen等［18］研究發現，3 t hm–2秸稈添加量及田間持水量厭氧處理與1.5 t hm–2添加量及淹水厭氧處理對鐮刀菌抑制無顯著差異。此外，厭氧消毒處理時間越長，消毒效果越好［15］。目前，對該方法相關的作用機理尚未清楚，仍需要進一步深入探討，從而為該項技術的應用提供理論基礎和實踐參考。Shennan等［10］認為今后應該注重針對不同土傳病害防控，優化方法，以及了解并揭示該方法防控病蟲害的機理機制。本研究的目的是探索不同碳源ASD對土傳病害青枯病防控、土壤改良及土壤微生物群落結構及多樣性的影響，從而揭示其對青枯病的防控機理，為實踐應用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

有機物料：選擇市場上容易獲得、使用廣泛和物料碳氮比差異較大的有機物料作為試驗材料。盆栽試驗選擇米糠、麥麩、茶麩、水稻秸稈，大田試驗則為米糠、麥麩、花生麩，均由市場購買，粗粉狀，有機物料的碳氮含量及粒徑見表1。

表1 有機物料碳氮含量及碳氮比Table 1 Carbon and nitrogen content and C / N ratio of the organic materials tested

試驗土壤：盆栽試驗土壤來自廣州市增城區 朱村鎮朱村（東經113.70°、北緯23.28°）的番茄種植基地，黏性土壤，其土壤特性如下：有機質16.4 g kg-1，全氮0.81 g kg-1，全磷1.12 g kg-1，全鉀27.9 g kg-1，堿解氮82.65 mg kg-1，有效磷72.80 mg kg-1，速效鉀120.3 mg kg-1，pH4.55，電導率（EC）0.062 mS cm-1。大田試驗在東莞市香蕉蔬菜研究所進行，土壤特性如下：pH 5.50，有機質18.32 g kg-1，堿解氮85.35 mg kg-1，有效磷118.3 mg kg-1，速效鉀229.17 mg kg-1。

試驗番茄品種：盆栽試驗選用易感青枯病的品種“臺灣紅圣女”。大田試驗番茄栽培品種為“紅艷櫻桃番茄”，由廣州市農業科學研究院育成。

青枯菌菌種：選用青枯菌生理小種Ⅰ生化型Ⅲ，由華南農業大學園藝學院提供。

1.2 盆栽試驗

盆栽試驗共設6個處理：對照（CK）、厭氧處理（D）、米糠+厭氧處理（DRB）、麥麩+厭氧處理（DWB）、茶麩+厭氧處理（DTB）、水稻秸稈+厭氧處理（DRS），每個處理6次重復，有機物料添加量均為土重的2%（w/w）。每個處理分別稱取2.0 kg供試土壤，20.0 ml青枯菌菌懸液（青枯菌含量108CFU ml-1），相應有機物料40.0 g，分別添加于盆缽中，充分混勻，澆水濕透，轉入20 cm×30 cm黑色自封袋中，密封厭氧處理3周。CK處理僅添加菌懸液，D處理不添加有機物料厭氧處理。所有處理于2016年5月8日至5月30日華南農業大學生態農場室外自然溫度進行處理，期間日均溫度為26.64℃，處理結束取土壤樣品待測，并打開自封袋放置數天，排出揮發物。將厭氧處理后的土壤轉移至花盆中，每盤移栽2株番茄幼苗。

厭氧處理3周結束，取一份土壤樣品測定青枯菌數量，提取土壤全DNA進行微生物高通量測序。另取一份土壤樣品測定氧化還原電位（Eh）、電導率（EC）和pH。番茄定植后，定期記錄發病率，試驗結束后測定番茄植株株高、莖粗、鮮重。

1.3 大田試驗

于2016年7月至12月在東莞市香蕉蔬菜研究所內（東經113.41°；北緯23.00°）進行田間試驗，供試土壤為番茄青枯病連作障礙土，上茬番茄青枯病發病率達85%以上。試驗設置對照（CK）、米糠+厭氧（DRB）、麥麩+厭氧（DWB）和花生麩+厭氧（DPB）4個處理，每個處理3次重復，共12個小區（10 m×1.2 m）。采用隨機區組設計，3種有機物用量均按1 kg m-2添加至指定小區，旋耕機充分混勻，鋪設滴管并蓋膜密閉，灌溉至完全濕透，厭氧處理3周。處理結束，去膜，放置數天，每個小區定植20株番茄幼苗，行距40 cm，株距50 cm。所有處理按照常規進行田間施肥管理，番茄生長前期按照750 kg hm-2施用一次復合肥。在番茄移栽后2、4、6、8周調查番茄青枯病的發病率，成熟期測定番茄株高和產量。

1.4 指標測定方法

土壤青枯菌數量：選用2, 3, 5-氯化三苯基四氮唑培養基［19］，采用平板計數法測定土壤中青枯菌數量。

土壤溫度：厭氧處理期間，采用紅外測溫儀于一天中土溫最高時段約15:00對土壤表層進行測定，每隔3 d測定一次，共測定5次，取平均值。土壤pH：以1.0 mol L-1KCl作為溶劑土液比1︰5，用雷磁PHS-3C型酸度計測定。土壤電導率（EC）：以水土比5︰1提取，SIN CT-TDS3031型電導率儀測定C。土壤氧化還原電位（ORP）：采用SX712型ORP計測定。

土壤細菌群落結構及多樣性分析：稱取0.5 g盆栽試驗厭氧消毒處理的土樣（6個處理，4個重復，共24個土壤樣品），使用試劑盒(MP Biomedical, Santa Ana, USA)提取土壤DNA，用瓊脂糖電泳檢驗提取DNA質量，用微量分光度計Nanodrop1000（Thermo Scientific，USA)測定DNA濃度與純度，并將其稀釋至10 ng μl－1放置于－80℃冰箱中待用。采用帶有barcoded 的特異引物341F (5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)，擴增16S rDNA的V3+V4區域的片段。PCR體系及程序按照 Phusion High-Fidelity PCR Master Mix(New England Bio labs)說明進行。使用瓊脂糖電泳對 PCR產物進行鑒定與分離。使用 Qiagen Gel Extraction Kit (Qiagen, Germany) 對 PCR產物進行回收用于后續建庫，產物進行回收用于后續建庫，Miseq2500 PE250平臺進行測序。

使用Mothurv 1.32［20］對測序序列進行組裝，對原始測序數據進行過濾及序列拼接，從24樣品總共得到優化序列853597條，優化序列按照97%的相似性，進行OTUs(Operational Taxonomic Units)聚合后，在Green Gene數據庫進行比對與注釋數據庫進行比對與注釋［21］。

基于O T U s對細菌α-多樣性指數A c e，Chao1，辛普森指數和香農指數進行估算［22-23］。基于樣品間OTUs的Unifrac距離，進行主成分分析(Principal component analysis, PCA)［24］，為了降低數據噪聲，我們使用物種至少在一個樣本中包含tags數量達到總tags數量的0.1%作為閾值，對滿足該條件的物種進行PCA分析。

1.5 數據處理

不同處理間差異的顯著性采用單因素方差分析與LSD法多重比較進行檢驗（one-way ANOVA，p＜0.05），以上統計分析通過SPSS 18.0實現，圖和表分別采用Origin 8.0和Office 2010制作。

2 結 果

2.1 土壤厭氧消毒對青枯菌的抑制及番茄生長的影響

由圖1可知，除了米糠+厭氧處理（DRB）外，土壤厭氧消毒能有效防控青枯病的發生并促進植株生長。與對照相比，添加有機物料厭氧處理青枯病發病率為0，僅厭氧處理（D）為16.7%。表明土壤厭氧消毒對青枯病防效達100%。除了添加米糠厭氧消毒對番茄生長無顯著影響外，其余厭氧處理均顯著提高植株鮮重、株高和莖粗。

2.2 土壤厭氧消毒對土壤理化性狀的影響

圖1 土壤厭氧消毒對盆栽植株發病率及生長的影響Fig. 1 Effect of anaerobic disinfestation of the soil on disease incidence and growth of plants (Pot experiment)

由圖2可以看出，所有厭氧處理均顯著提高了土壤溫度，平均提高6～8℃。與CK相比，單純的厭氧處理（D）對土壤pH沒有顯著影響，而不同碳源的ASD處理顯著提高土壤pH，提高幅度為8%～13%。厭氧處理均顯著降低了土壤Eh，且添加有機物料厭氧處理Eh均為負值，使土壤呈強還原性狀態。各處理對EC的影響不一致，與CK相比，添加米糠（DRB）和不添加物料（D）處理EC值無顯著變化，而添加麥麩（DWB）、茶麩（DTB）和秸稈（DRS）處理EC值顯著提高了10倍以上。

圖2 土壤厭氧消毒對土壤理化性質的影響Fig. 2 Effect of anaerobic disinfestation on soil physical and chemical properties

2.3 土壤厭氧消毒對土壤青枯菌數量的影響

由圖3可知，與對照相比，添加有機物料的厭氧消毒顯著降低了土壤中可培養青枯菌數量，降低幅度為81.0%～96.5%，且降低幅度呈數量級，而單純的厭氧處理（D）土壤中可培養青枯菌含量與對照無顯著差異。

2.4 土壤厭氧消毒對土壤細菌群落結構與多樣性的影響

土壤厭氧消毒能顯著影響土壤細菌群落多樣性。由表2可得，α多樣性指數Ace、Chao1、辛普森和香農對不同處理的響應及趨勢基本一致，即CK、D和DRB處理均顯著高于DWB、DTB和DRS。與對照相比，添加有機物料厭氧處理降低了土壤細0.05 level菌的多樣性，降低幅度因添加物料種類而異。

圖3 土壤厭氧消毒對土壤青枯菌數量的影響Fig. 3 Effect of anaerobic disinfestation on population of Ralstonia solanacearum in the soil

表2 土壤厭氧消毒對土壤細菌群落多樣性指數的影響Table 2 Effects of anaerobic disinfestation on soil bacterial diversity index

在門水平下對樣品間細菌群落進行主成分分析，以觀察不同處理下對微生物影響的相關聯性，結果如圖4所示。經過PCA降維后，所提取的PC1對總方差的解釋率為48.7%，PC2的解釋率為15.2%，兩者總占比為63.7%。從PC1看，6個處理明顯分為兩類，第一類在PC1的值為正值，包含DWB（麥麩）、DTB（茶麩）、DRS（秸稈）。第二類在PC1的值為負值，包含CK、D、DRB等。而且有一個非常有趣的現象，6種處理出現兩兩以Y軸對稱分布的現象，CK與DWB對稱，D與DTB對稱，DRB與DRS對稱。

圖4 門水平上的主成分分析Fig. 4 Principal component analysis on the phylum level

對不同處理細菌主要門類進行分析，結果如圖5。不同處理豐度前10的細菌門類均為泉古菌門（Crenarchaeota）、廣古菌門（Euryarchaeota）、酸桿菌門（A c i d o b a c t e r i a）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、厚壁菌門（Firmicutes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）和變形菌門（Proteobacteria），表明厭氧消毒并無改變土壤主要微生物的門類，但能顯著改變優勢種群的比例。與CK相比，全部厭氧處理的泉古菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門及變形菌門細菌相對豐度均有所下降，而添加有機物料厭氧處理組厚壁菌門相對豐度顯著增加，其中DWB、DTB和DRS增加最為顯著。放線菌門相對豐度在各處理間變化不一，D和 DRB處理較CK顯著增加，而DWB、DTB和DRS則顯著降低。

厚壁菌門微生物進一步分析表明，厚壁菌門中梭菌科、瘤胃菌科和芽孢桿菌科3個科的細菌變化幅度最大。與對照相比，D、DRB處理組的梭菌科（大部分為厭氧菌）相對豐度無顯著差異，而DWB、DTB和DRS顯著提高，其中DWB處理數值最高且顯著高于其他處理組（圖6）。除DTB處理的瘤胃菌科和芽孢桿菌科的相對豐度顯著高于CK，其他處理組無顯著差異，但總體上表現為DWB、DTB、DRS處理組的相對豐度高于CK、D、DRB。

2.5 土壤厭氧消毒的田間示范效應

由圖7可以看出，番茄定植第2周開始發病，CK組發病率始終高于其他厭氧處理組，DRB、D W B、D P B處理番茄發病率較C K分別降低71.2%、55.9%、50.6%。與CK相比，各厭氧處理均顯著提高了番茄產量，增幅達2.5倍～4.7倍，其中麥麩+厭氧處理（DWB）產量增幅最大，米糠+厭氧處理（DRB）最小。此外，DWB和DPB能顯著提高番茄株高和莖粗，而DRB則無顯著影響。值得注意的是，DRB處理組對青枯病防控效果最好，但番茄株高和莖粗均小于CK，植株矮小。

圖5 土壤厭氧消毒對土壤細菌群落結構的影響Fig. 5 Effect of anaerobic disinfestation on the bacterial community structure in the soil

圖6 梭菌科、瘤胃菌科和芽孢桿菌科相對豐度變化Fig. 6 Relative abundance of Clostridiaceae, Ruminococcaceae and Bacillaceae

3 討 論

3.1 土壤厭氧消毒對青枯病的防控作用

圖7 土壤厭氧消毒對大田植株發病率及生長的影響Fig. 7 Effect of anaerobic soil disinfestation on disease incidence and plant growth (Field experiment)

以往研究表明［25］，ASD處理能夠有效抑制50%～94%的病原細菌、卵菌（oomycete）和真菌，對線蟲抑制率達15%～56%，對雜草抑制率達32%～81%，并能顯著提高作物的產量。van Overbeek等［26］運用ASD長時間處理青枯菌病土，能使土壤中青枯菌數量降低99.4%以上。伍朝榮等［13］研究發現，ASD對番茄青枯病的防控效果達90%以上，且顯著促進了番茄生長。本研究中，盆栽和大田試驗結果均表明，不同有機物料（米糠、麥麩、茶麩、秸稈）ASD處理對番茄青枯病具有較好的防控效果，且能促進作物的生長（除DRB外），提高番茄產量。不同碳源添加對青枯菌的抑菌效果與碳源C/N有關（圖3），DWB（C/N=43.7）和DTB（C/N=49.6）殺菌效果優于DRS（C/N=72.7）和DRB（C/N=81.9），這與Liu等［27］報道的有機物料C/N與RSD殺菌效果之間存在負相關的結論一致，也是本試驗選擇不同C/N有機物料的原因。盆栽和田間試驗發病率ASD處理均顯著低于對照，但田間試驗仍呈高狀態，原因可能包括:（1）大田作為一個開放狀態，ASD處理過程中難以形成與盆栽相對密封厭氧狀態；（2）灌溉方式、農用機械工具、人工修剪等病原菌傳播，從而影響了實際處理效果。

3.2 土壤厭氧消毒對土壤特性的影響

ASD通過添加有機物料和厭氧發酵，能在短時間內顯著改變土壤理化性質，主要包括pH，Eh和EC等的變化。土壤pH變化與添加物料種類和土壤類型有關，大多數研究發現ASD能產生有機酸，使pH小幅度降低［28-29］。本研究土壤pH升高可能與試驗用土pH（4.55）較低有關。ASD處理使Eh則由正值快速降低至負值，并持續整個厭氧處理過程，該指標能間接顯示土壤已形成厭氧環境［30］。而青枯病原菌是一種好氧型細菌，厭氧條件下，其生長生理等方面可能受到極大的抑制。ASD處理下EC總體上也是呈增長態勢，主要是ASD處理過程釋出部分正負離子［31］。本試驗Eh顯著降低和EC的提高均與前人研究結果類似。

3.3 土壤厭氧消毒對土壤微生物群落結構的影響

ASD能在短時間內形成厭氧、強還原性、高溫等環境，并能產生揮發性氣體、有機酸、低價重金屬等各類有毒物質，這導致土壤微生物群落結構也發生變化。土壤微生物群落結構的變化可能是土壤厭氧消毒防控土傳病害的機理之一［17］。如病原菌數量減少或致病力降低可以達到防控病害的效果。研究表明，ASD處理能誘導土壤微生物群落結構發生顯著變化，增加土壤中的拮抗菌數量從而降低病原菌的危害［6,32-34］。

本研究的土壤微生物高通量測序結果顯示，添加不同有機物料（DRB、DWB、DTB和DRS）土壤厭氧消毒中厚壁菌門（Firmicutes）相對豐度大幅提高，其中DWB、DTB和DRS處理的厚壁菌門的相對豐度占主導。該門下的梭菌科和瘤胃菌科（大部分為厭氧菌）、芽孢桿菌科（耐性強）的相對豐度也大幅提升，這與Mowlick［33］結果相似，這些細菌種類可能對青枯菌產生拮抗作用，但仍需進一步驗證。比如Ueki等［35］從土壤厭氧消毒處理中分離到梭菌屬（Clostridium）的兩株厭氧型菌株（H110和TB8）能破壞鐮刀菌細胞壁，達到致死該病原菌的作用。Strauss等［36］研究結果顯示ASD能改變土壤細菌群落結構，影響致死病原農桿菌和腐霉菌。不同有機碳源的ASD 處理微生物群落結構變化存在一定差異，優勢群落相對豐度的增加總體趨勢一致。因此，土壤厭氧消毒通過提高厚壁菌門細菌群落豐度，促進厭氧型和耐受型等細菌生長，從而抑制包括病原菌等其他細菌群落生長，達到控制病害的效果。

Tomihama等［37］研究表明農田添加米糠能有效提高土壤中放線菌相對豐度，放線菌含大部分拮抗菌，從而對馬鈴薯瘡痂病的防控有促進作用。本試驗添加米糠的厭氧消毒（DRB）番茄株高、莖粗和鮮重等指標均低于CK，但防控青枯病效果較佳，這可能與該處理放線菌相對豐度顯著高于CK有關。本研究還初步發現，不同有機物料添加產生的揮發性氣體均能有效抑制青枯菌的生長。雖然不同有機物料厭氧消毒產生的殺菌物質不盡相同［16］，但也有相同物質產生，有研究發現ASD處理產生的氨氣、乙酸和丁酸能大幅度抑制土壤茄勞爾氏菌的數量［28，38］。此外，本實驗及相關研究表明ASD處理土壤氧化還原電位變為負值、溫度升高、pH升高等引起的厭氧環境的變化，可能不利于青枯菌生長。總之，ASD防控番茄青枯病的機理包括多個方面，而改變土壤微生物群落結構，可能是重要機理之一。

4 結 論

盆栽條件下，通過添加不同碳源ASD處理均能提高土壤pH、土溫，形成還原性（厭氧）環境，土壤細菌多樣性指數降低，部分厭氧型、耐性強的細菌相對豐度也大幅提升，成為優勢種群。這有效抑制了土壤中青枯病原菌數量及其對番茄的侵染，大大降低青枯病發病率。ASD田間示范，同樣表現出能顯著降低番茄青枯病的發生，促進植株健康生長，大幅提高番茄產量。研究表明，該方法對防控青枯病具有較好效果，值得進一步推廣應用。