白藜蘆醇對缺氧誘導胃癌細胞的上皮間質轉化的抑制作用及其可能機制

陳四喜 陳瑞紅 包春宇 徐剛

胃癌是世界上最常見的原發性胃腸道惡性腫瘤之一[1]，盡管目前在診斷方法上有所改進，但胃癌患者的預后仍然極差，且大多數癌癥患者的死因不是原發腫瘤而是腫瘤轉移。腫瘤轉移的發生需要上皮細胞的遷移和侵襲，而上皮間質轉化是上皮細胞轉移的基礎[2]。研究表明，缺氧可能是EMT的誘發因素之一，介導這一反應的關鍵轉錄因子之一即缺氧誘導因子1α(HIF-1α)，且HIF-1α與細胞增生、轉移、血管生成、上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)及腫瘤進展密切相關[3]。已有大量研究結果表明白藜蘆醇能顯著的抑制多種腫瘤細胞的上皮間質轉化過程，但在不同的腫瘤細胞中，其機制卻有所不同[4-5]。本研究目的在于探討白藜蘆醇是否對缺氧誘導的胃癌細胞上皮間質轉化過程具有抑制作用，為胃癌的治療提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株 胃癌SGC-7901細胞由河南省信陽市解放軍第一五四醫院實驗室保存。

1.2 主要試劑 胎牛血清：浙江天航生物科技有限公司；RPMI 1640培養基：美國Hyclone公司；MTT粉、CoCl2粉：美國Sigma公司；TRIzol試劑：美國Invitrogen公司；RNA逆轉錄試劑盒：美國Fermentas公司；2×Tag Mix：北京威格拉斯生物技術公司；RNA引物：上海生工生物工程有限公司；HIF-1α、Snail、E-cadherin及vimentin兔抗人單克隆抗體：美國Cell Signaling Technology公司；HRP標記山羊抗兔二抗：北京中杉金橋有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MTT試驗 復蘇胃癌細胞SGC-7901置于37℃ 5%CO2的培養箱中培養24 h，取處于對數生長期的細胞，接種于96孔板中，分別配制白藜蘆醇濃度為300、200、150、100、50、25、12.5和6.25 μmol/L的培養液，加入96孔板中，放入培養箱中培養24 h后，每孔中再加入濃度為5 mg/mL的MTT液20μL，繼續放入培養箱中培養4 h后，吸去上清液，每孔中加入100 μL DMSO試劑進行溶解，將96孔板放在酶標儀上，對各孔在490 nm處的吸光值進行測定。取每組6個平行孔吸光值的均數，按照公式計算細胞生長抑制率(inhibition rate，IR)：IR＝(1－加藥組吸光值均數/對數組吸光值均數)×100%。然后根據IR值計算出白藜蘆醇對胃癌細胞的半數抑制濃度(IC50值)，后續實驗中白藜蘆醇濃度均參照該濃度。

1.3.2 細胞劃痕試驗 取處于對數生長期的胃癌細胞，接種于六孔板中，分別設立對照組(普通培養基)、白藜蘆醇組(含白藜蘆醇的培養基)、缺氧組(含CoCl2的培養基)、白藜蘆醇＋缺氧組(含白藜蘆醇和CoCl2的培養基)，放入培養箱中培養24 h后，用10 μL槍頭沿板底垂直劃痕，再用PBS液進行沖洗3次，去除劃下的細胞，再將六孔板放培養箱中培養24 h，在光學顯微鏡下進行觀察，取樣拍照。

1.3.3 熒光定量PCR試驗 將四組細胞培養24 h后進行收集，按照TRIzol試劑說明書上的步驟，提取出各組胃癌細胞的總RNA，然后按照反轉錄試劑盒說明書上的步驟將總RNA反轉錄為cDNA，參照引物序列，使用ABI 7300 Real-time PCR System對cDNA進行擴增，然后對擴增的結果進行分析(引物序列表1)。將反轉錄后的cDNA稀釋后，取2 μL作為模板，配置好反應體系。按照初始變性95 ℃ 10 min，變性95 ℃ 15 s，退火/延伸60 ℃ 31 s，進行40個循環。每份cDNA樣品在相同的條件下按以上步驟進行基因表達水平的檢測，所有的樣品均重復試驗3次，采用相對定量2－△△Ct法計算目的基因的mRNA表達水平。

表1 RT-qPCR引物序列及擴增片段大小

1.3.4 Western Blot試驗 將對照組、白藜蘆醇組、缺氧組、白藜蘆醇＋缺氧組四組細胞分別培養24 h后進行收集。使用細胞裂解液提取出總蛋白，制備成蛋白樣品后，在電泳儀上依次進行灌膠、上樣、電泳，在轉膜儀上進行轉膜，結束后將膜泡在封閉液(5%的牛奶)里在室溫條件下封閉1 h，再將膜泡在一抗稀釋液中，雜交袋封閉，4℃過夜，進行一抗孵育。用TBST溶液在室溫下對孵育后的膜進行脫色。用同上方法進行二抗孵育，然后依次化學發光、顯影、定影。將定影后的膠片進行拍照，通過Image J軟件測定的特異性蛋白條帶的密度。

1.4 統計學處理 以上試驗均重復3次，采用SPSS 16.0軟件對實驗的結果進行統計分析，計量資料結果均采用(±s)表示，組間比較采用t檢驗，多組均數間比較采用方差分析方法比較。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 MTT試驗檢測 MTT試驗結果顯示在相同培養條件下，白藜蘆醇對正常組和缺氧組胃癌細胞SGC-7901的增生均有顯著的抑制作用，且隨著白藜蘆醇濃度的增加，抑制作用逐漸增強。在缺氧和正常條件下，白藜蘆醇對SGC-7901細胞的IC50值分別為(42.69±2.04)μmol/L和(40.57±1.83)μmol/L(圖1)，綜合考慮，我們將白藜蘆醇濃度40 μmol/L作為后續試驗的藥物濃度。

圖1 MTT試驗檢測白藜蘆醇對缺氧誘導的胃癌細胞SGC-7901的增生抑制作用

2.2 細胞劃痕試驗結果 在顯微鏡下觀察并測量各組細胞劃痕間寬度，在胃癌細胞SGC-7901中，結果均顯示劃痕寬度白藜蘆醇組＞對照組＞白藜蘆醇＋缺氧組＞缺氧組，提示缺氧誘導胃癌細胞后(缺氧組)細胞的侵襲能力明顯增強，而白藜蘆醇作用后(白藜蘆醇＋缺氧組)細胞的侵襲能力明顯減弱，表明白藜蘆醇對缺氧誘導的胃癌細胞SGC-7901的侵襲轉移有明顯的抑制作用(圖2)。

圖2 劃痕實驗檢測四組胃癌SGC-7901細胞的遷移侵襲能力×100

2.3 熒光定量PCR試驗結果 在胃癌細胞SGC-7901中，各組HIF-1α mRNA的相對表達量無明顯升高或降低(差異無統計學意義P＞0.05，圖3)。而與對照組相比，缺氧組中Snail、vimentin mRNA相對表達水平均明顯升高，E-cadherin mRNA表達水平均明顯降低，而白藜蘆醇＋缺氧組表達水平與對照組相似，較缺氧組表達水平明顯降低。白藜蘆醇組與對照組相比，Snail、vimentin mRNA表達水平下降，E-cadherin mRNA表達水平升高，即缺氧誘導胃癌細胞后，對缺氧誘導因子HIF-1α基因的表達無明顯影響，而導致胃癌細胞上皮間質轉化相關因子基因表達明顯增強，白藜蘆醇對缺氧誘導的胃癌上皮間質轉化相關因子基因表達有明顯的抑制作用(圖4)。

圖3 熒光定量PCR試驗檢測各組胃癌細胞中HIF-1α mRNA相對表達量

圖4 熒光定量PCR試驗檢測各組胃癌細胞中EMT相關分子mRNA相對表達量

2.4 Western Blot試驗結果 在胃癌細胞SGC-7901中，與對照組相比，缺氧組HIF-1α蛋白表達水平明顯升高，而白藜蘆醇＋缺氧組表達水平與對照組相似，較缺氧組表達水平明顯降低。白藜蘆醇組與對照組相比，HIF-1α蛋白表達水平下降(圖5)。與對照組相比，缺氧組Snail、vimentin蛋白表達水平明顯升高，E-cadherin蛋白表達水平明顯降低，而白藜蘆醇＋缺氧組表達水平與對照組相似，較缺氧組表達水平明顯降低。白藜蘆醇組與對照組相比，Snail、vimentin蛋白表達水平下降，E-cadherin蛋白表達水平升高，即缺氧誘導胃癌細胞后，導致胃癌細胞缺氧誘導因子HIF-1α及上皮間質轉化相關因子蛋白表達明顯升高，而白藜蘆醇對缺氧誘導的胃癌上皮間質轉化相關因子蛋白表達有明顯的抑制作用(圖6)。

圖5 Western Blot試驗檢測四組胃癌SGC-7901細胞內HIF-1α蛋白的表達情況

圖6 Western Blot試驗檢測四組胃癌SGC-7901細胞內Snail、E-cadherin和vimentin蛋白的表達情況

3 討論

白藜蘆醇是一種低分子的植物抗毒素，是植物在應對某些外界刺激時所產生的一種代謝產物。研究表明，在多種惡性腫瘤如前列腺癌、乳腺癌及結腸癌中，白藜蘆醇表現出了較好的抗腫瘤活性[6]。

微環境缺氧是實體腫瘤的一種常見特性，其導致腫瘤微血管系統的異常及腫瘤的快速生長。隨著實體腫瘤的不斷生長，對脈管系統氧供需求增大，腫瘤內出現缺氧狀態，誘發腫瘤細胞內的缺氧反應體系，HIF-1α是腫瘤細胞為了耐受缺氧而表達的一種因子，在常氧狀態時被泛素化降解。當腫瘤細胞處于缺氧狀態時，泛素化降解過程被阻斷，HIF-1α在細胞內逐漸累積。在多種實體腫瘤中均可發現HIF-1α的高表達和累積[7-9]。本研究顯示，缺氧條件下，HIF-1α在胃癌細胞中存在累積。

上皮間質轉化是原發腫瘤上皮癌細胞失去細胞極性和細胞間黏附，并增加遷移和侵襲特性，從而成為間充質細胞的一種生物學過程。腫瘤細胞發生轉移的關鍵步驟之一是上皮間質轉化[10]，因此通過阻止其上皮間質轉化從而抑制腫瘤的侵襲轉移已成為目前腫瘤治療的新策略之一。上皮間質轉化的誘導因素很多，缺氧也被認為是其中重要的誘導因素之一。缺氧誘導腫瘤細胞的EMT過程主要是通過HIF-1α介導的[11]。在缺氧狀態下，HIF-1α通過上調Snail基因的轉錄，促進Snail的表達從而引起腫瘤細胞發生上皮間質轉化[12]。本研究顯示，缺氧可以誘導人胃癌SGC-7901細胞的EMT，主要表現為相關因子vimentin的表達增加和E-cadherin的表達減少。

本研究發現，缺氧通過引起胃癌細胞中HIF-1α的累積，誘導胃癌細胞的EMT過程，表現為EMT相關因子Snail、vimentin表達的上調和E-cadherin表達的下調，同時表現為胃癌細胞的遷移能力明顯增強，而白藜蘆醇能顯著抑制這一過程，且白藜蘆醇抑制HIF-1α蛋白的累積而對HIF-1α mRNA水平無影響，具體機制還需進一步深入研究。

有研究顯示，白藜蘆醇是組蛋白去乙酰化酶Sirtuin1(SIRT1)最有效的激活劑，且白藜蘆醇的多種活性都是通過SIRT1介導的，SIRT1可以使腫瘤細胞內信號通路轉錄因子和其他蛋白去乙酰化而失去活性[13]。已有研究證實，組蛋白乙酰化酶PCAF可以通過對HIF-1α的乙酰化作用使其激活，同時被激活的HIF-1α又可以在SIRT1的去乙酰化作用下失去活性，PCAF和SIRTl分別通過乙酰化和去乙酰化作用來調控HIF-1α的活性[14-15]，這表明，白藜蘆醇可以通過SIRT1對HIF-1α的去乙酰化作用使HIF-1α失去活性。

綜上所述，本研究表明，白藜蘆醇對胃癌細胞侵襲和轉移的影響是通過抑制HIF-1α的累積從而抑制胃癌細胞的上皮間質轉化介導的，盡管其具體機制還有待進一步研究，但這一結果為胃癌的靶向化療提供了新的方向，同時白藜蘆醇是否通過SIRT1的去乙酰化作用抑制HIF-1α的累積從而抑制胃癌細胞的EMT過程還有待進一步研究證實。