珍珠蓮中主要成分高圣草酚的藥代動力學研究

謝瑤，周妮，孫志偉，黃靜，秦文

（湖北三峽職業技術學院醫學院，湖北 宜昌 443000）

珍 珠 蓮 Ficus sarmentosa var.henryi（King）Corner為桑科榕屬攀援藤狀灌木，廣泛分布于華東、華南和華西各省［1］，具有祛風除濕、消腫止痛、解毒殺蟲的功效，可用于治療風濕性關節痛、腸炎、痢疾等疾患［2］。王學貴等［3］通過對珍珠蓮中的黃酮類化學成分的分離鑒定，發現高圣草酚為其主要成分。現代藥理學研究表明高圣草酚有抑制異常的毛細血管通透性增加及阻力下降，擴張冠狀動脈，影響血壓，增加冠脈血流量，改善微循環等重要生物活性［4］。本研究檢測不同給藥途徑下大鼠血漿中高圣草酚的濃度，研究高圣草酚的藥代動力學過程，計算腹腔注射和靜脈注射高圣草酚的藥代動力學參數，為高圣草酚不同劑型的制備以及臨床應用提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 藥品 珍珠蓮藥材購于宜昌市宜草堂大藥房，由湖北三峽職業技術學院醫學院藥學教研室胡興娥教授鑒定為珍珠蓮Ficus sarmentosa var.henryi（King）Corner。高圣草酚對照品由本實驗室分離提純，經紫外分光光度法（UV）、質譜（MS）、核磁共振（NMR）分析數據確證其結構為高圣草酚，對照品純度高于98%。內標物黃芩苷購自中國藥品生物制品檢定所。

1.2 試劑與動物 乙腈和甲醇為色譜純（美國Fisher Scientific公司），甲酸為色譜純（天津康克德公司），實驗用水為娃哈哈純凈水。12只雄性SD大鼠，體重（230±20）g，由三峽大學動物實驗中心提供（許可證號為：SCXK（鄂）20170012）。

1.3 儀器 WATERS ACQUITYTM UPLC超高效液相色譜儀、質譜儀（美國Waters公司），Thermo Syncronis C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）（美國Thermo公司），渦旋混合器（XK96-B，姜堰市新康醫療器械有限公司），氮吹儀（D10型，杭州藍焰科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 色譜/質譜條件 色譜柱為Thermo Syncronis C18色譜柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相A為0.2%甲酸溶液，流動相B為乙腈溶液，梯度洗脫，洗脫程序為：（1）0～4 min，流動相B比例由20%上升至25%；（2）4～6.5 min，流動相B比例由25%上升至75%。流速0.25 ml/min，柱溫30℃。

離子源為ESI源，正離子模式，質譜多反應監測（multiple-reaction-monitoring，MRM）檢測，高圣草酚及內標黃芩苷質譜條件見表1，MS/MS質譜圖見圖1，源噴霧電壓為3.2 kV，離子源溫度為120℃，去溶劑氣體為N2，溫度為400℃，流速為600 L/h。碰撞氣Ar壓力為2.95×10-3mbar。

表1 高圣草酚及內標黃芩苷最優化MRM條件

圖1 高圣草酚（A）與內標黃芩苷（B）的化學結構及質譜圖

2.2 溶液的配制 對照品儲備液的配制：取高圣草酚對照品適量，置于100 ml容量瓶中，用甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，配制成100 mg/L的高圣草酚儲備液，臨用前用甲醇稀釋。

內標溶液的配制：取黃芩苷對照品5 mg，精密稱定，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度；精密量取上述溶液1 ml，置于100 ml容量瓶中，加甲醇溶液溶解并稀釋至刻度，即得。

2.3 血漿樣品預處理 取待測血漿樣品100 μl于1.5 ml具塞離心管中，加入甲醇與內標溶液各10 μl，混勻后加入 500 μl 0.2%甲酸-乙腈溶液，渦旋混勻5 min后15 000 r/min離心10 min。轉移上清液于另一離心管中，35℃氮氣吹干，取100 μl溶劑（乙腈-水，25∶75，v/v）復溶，溶液在4℃離心機中離心10 min后進樣，進樣量為10 μl。

3 生物樣品方法學考察

3.1 方法專屬性 大鼠空白血漿、空白血漿加對照品高圣草酚及內標、靜脈注射1 h后血漿樣品加內標的色譜圖見圖2，結果表明血漿中雜質不干擾樣品及內標物的測定。高圣草酚的保留時間為3.0 min，內標的保留時間為2.7 min。

圖2 血漿中高圣草酚和內標黃芩苷色譜圖

3.2 線性關系及定量下限 配成濃度相當于4.0、10、50、100、200、400、800 ng/ml的高圣草酚血漿標準溶液，再按“2.3項”處理后檢測，測定高圣草酚峰面積AS、內標峰面積AI，以AS/AI為縱坐標（Y），以所對應各點濃度C為橫坐標（X）繪制標準曲線。得高圣草酚的標準曲線回歸方程Y=0.225X+0.398（r=0.9938）。定量下限為 4.0 ng/ml（n=7，RSD=2.35%）。

3.3 精密度與準確度 取空白大鼠血漿100 μl，按“2.3項”下方法配制低、中、高3個質量濃度（分別為10、100、640 ng/ml）的高圣草酚血漿樣品，每個質量濃度進行6個樣品分析，連續測定3 d，用當日標準曲線計算高圣草酚樣品的質量濃度，從而考察方法的精密度與準確度，結果見表2。

3.4 提取回收率 取空白大鼠血漿100 μl，按“2.3項”下方法配制低、中、高3個質量濃度（分別為10、100、640 ng/ml）的高圣草酚血漿樣品，每個質量濃度進行6個樣品分析，另取空白血漿100 μl，按“2.3項”下操作，獲得的上清液中加入相應質量濃度的標準溶液 10 μl和內標溶液 10 μl，氮氣流下吹干，將殘留物加入100 μl甲醇溶解，取10 μl進樣，獲得相應峰面積比（3次測定的平均值）。以每一種濃度2種處理方法的峰面積比值計算提取回收率。結果見表2，內標黃芩苷的提取回收率為85.8%。

3.5 基質效應 取空白血漿100 μl，除不加混合系列標準溶液和內標溶液外，按“2.3項”下操作，向獲得的上清液中加入低、中、高3個質量濃度的高圣草酚標準溶液 10 μl和內標溶液 10 μl，渦旋混合，于35℃干浴，氮氣流下吹干，以100 μl流動相溶解后進樣分析，獲得相應峰面積，每一濃度進行6個樣品分析；同時另取相應濃度的標準溶液 10 μl和內標溶液 10 μl，35 ℃干浴，氮氣流下吹干，以100 μl流動相溶解后進樣分析，獲得相應峰面積（6次測定的平均值）。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算基質效應。結果見表2，表明本方法測定大鼠血漿中高圣草酚及內標時無明顯基質效應。

表2 高圣草酚的精密度與準確度（n=6）

3.6 樣品穩定性 取空白大鼠血漿100 μl，按“2.3項”下配制為低、中、高3個質量濃度（10、100、640 ng/ml）的高圣草酚血漿標準品溶液，每種濃度3份，經歷3次冰凍-解凍循環后，考察其穩定性。低、中、高3個濃度的RSD分別為5.5%、4.8%、3.5%，結果顯示凍融條件對血漿樣品的檢測結果沒有明顯的影響。

4 高圣草酚在大鼠體內的藥代動力學研究

4.1 珍珠蓮注射劑的制備 取珍珠蓮藥材適量，各分別加入10倍、8倍量的95%乙醇液回流提取3次，每次2 h，合并3次醇提液，過濾，減壓回收乙醇，殘渣加適量水溶解，備用。

4.2 給藥方案 將12只SD大鼠隨機分成2組，給藥前每組均禁食12 h（不禁水），分別腹腔注射和靜脈注射（20 g/kg）給藥。分別于給藥后2、5、10、20、40、60、90、120、180、240、360、480 min眼眶取血0.25 ml，注入肝素化的試管，離心5 min（10 000 r/min）取血漿，-20℃冷凍保存備測。

4.3 血藥濃度-時間曲線及藥物動力學參數 采用DAS2.1藥動學軟件處理血藥濃度-時間數據，得到高圣草酚的藥代動力學參數，并比較其腹腔注射和靜脈注射的藥動學過程，結果發現，靜脈注射組的 AUC0-t、AUC0-∞、CLZ/F明顯大于腹腔注射組，同時MRT明顯低于腹腔注射組；靜脈注射組對珍珠蓮中高圣草酚的血漿清除率約為腹腔注射組的2～3倍，腹腔注射組高圣草酚的半衰期遠大于靜脈注射組，差異均有統計學意義（P＜0.05），見表3。大鼠單劑量腹腔注射及靜脈注射給予20 g/kg高圣草酚后，血藥濃度-時間曲線見圖3。

圖3 大鼠單劑量腹腔注射及靜脈注射給予20 g/kg高圣草酚后的血藥濃度-時間曲線圖

表3 腹腔注射和靜脈注射給予珍珠蓮注射液后高圣草酚的主要藥動學參數

5 討論

5.1 色譜條件的選擇 本實驗選擇0.2%甲酸溶液（流動相A）與乙腈（流動相B）為洗脫溶劑，研究最初，曾嘗試采用等度洗脫，曾考察色譜條件A∶B=55∶45（v/v），在該色譜條件下，高圣草酚峰形良好，但內標黃芩苷與血漿內源性物質分離度R＜1.5；在A∶B=38∶62（v/v）的色譜條件下，內標物黃芩苷與血漿內源性物質分離良好，但高圣草酚色譜峰拖尾嚴重，拖尾因子T＞1.2，因此本研究采用梯度洗脫，洗脫程序為：（1）0～4 min，流動相B比例由20%上升至25%；（2）4～6.5 min，流動相B比例由25%上升至75%。在該色譜條件下血漿內源性物質、黃芩苷、高圣草酚分離良好，黃芩苷、高圣草酚色譜峰拖尾因子T均＜1.1。

5.2 質譜條件的選擇 高圣草酚［M+H+］峰響應值優于［M+Na+］峰，因此本研究選擇［M+H+］峰的正離子選擇模式監測，因其響應遠高于負離子選擇模式檢測。

5.3 藥代動力學特點 從腹腔注射和靜脈注射2種給藥途徑藥動學結果來看，高圣草酚靜脈給藥后，大鼠體內代謝迅速。本結果顯示高圣草酚腹腔給藥的消除半衰期為（1.37±0.33）h，靜脈注射的消除半衰期為（0.67±0.30）h，差異有統計學意義（P＜0.05）。血漿藥物濃度經DAS2.1程序處理，高圣草酚在大鼠體內經腹腔與靜脈注射給藥后的藥代動力學參數中 AUC0-t、AUC0-∞、MRT、CLZ/F差異亦有統計學意義。這可能與高圣草酚在大鼠體內的吸收與代謝機制有關［5］。從藥時曲線分布可知，靜脈注射后血藥濃度幾分鐘就迅速下降了幾倍，這可能是高圣草酚經靜脈注射后迅速向各臟器分布［6］。

綜上所述，由于高圣草酚吸收和代謝的速度較快，靜脈注射可用于急性發病期。但是由于吸收時間較長，選擇腹腔給藥方式可以降低高圣草酚的不良反應和毒性，因此可用于慢性發病期治療。