孕期雙酚A暴露對子代雄性大鼠生殖發(fā)育的影響

張昭玉，馬林，李昀謙，王晨，趙曉茹，羅家權(quán)，馬明月*

（1.沈陽醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)專業(yè)2015級，遼寧 沈陽 110034；2.衛(wèi)生毒理學(xué)教研室）

雙酚A（bisphenol A，BPA），溶于水，易溶于醇、醚等，廣泛應(yīng)用于染料、殺菌劑、醫(yī)療器械、餐具、罐頭內(nèi)包裝、飲料容器與食品包裝材料、嬰兒奶瓶的生產(chǎn)等［1-2］，是目前應(yīng)用較廣泛的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物。BPA可通過干擾內(nèi)分泌系統(tǒng)對機體健康產(chǎn)生各種危害，如對生殖系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)的損害，與2型糖尿病及肥胖等的發(fā)生相關(guān)。已有研究證實，BPA可通過產(chǎn)生自由基造成組織器官和細胞的氧化應(yīng)激，具有較強的氧化損傷作用［3-5］。BPA主要通過消化道等途徑進入人體，在發(fā)育過程中可通過阻滯生殖細胞的減數(shù)分裂誘導(dǎo)細胞凋亡，影響睪丸發(fā)育系統(tǒng)，導(dǎo)致生殖系統(tǒng)損傷［6］。BPA對女性生殖系統(tǒng)的影響研究較多，但對男性生殖系統(tǒng)的影響報道甚少。因此本研究通過大鼠孕期BPA暴露，研究BPA對子代雄性大鼠生殖系統(tǒng)及機體抗氧化系統(tǒng)的損傷，為評估BPA對人群的危害及探討其損傷機制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 15只SPF級健康雄性SD大鼠、30只健康雌性SD大鼠（10周齡）由遼寧長生生物技術(shù)有限公司提供，實驗動物許可證號SYXK（遼）2010-0002，體重200～240 g，按1∶2比例進行合籠，次日晨起行陰栓檢查，發(fā)現(xiàn)陰栓為妊娠第0天（gestation day 0，GD0）。動物飼養(yǎng)在符合GB 14925—2010《實驗動物環(huán)境及設(shè)施》有關(guān)要求的屏障環(huán)境中，12 h/12 h晝夜光照循環(huán)，動物室相對溫度（25±2）℃，相對濕度（50±2）%，自由進食、飲水。

將受孕雌性大鼠隨機分成3組，溶劑對照組、BPA低劑量組（33.3 mg/kg）、BPA高劑量組（100 mg/kg），每組10只，各組均以5 mg/kg的體積進行灌胃。染毒從GD5開始，持續(xù)到GD21。子代雄性大鼠正常喂養(yǎng)至第10周后乙醚麻醉，腹主動脈采血分離血清備用，分離臟器檢測各指標。

1.2 主要儀器與試劑 酶標儀、低速臺式大容量離心機（美國Thermo公司）；正置顯微鏡（日本Nikon公司）；BPA（純度＞99%，東京化成工業(yè)株式會社）；玉米油（阿拉丁試劑（上海）有限公司）；乙醚（分析純，中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、過氧化氫（H2O2）、過氧化氫酶（CAT）試劑盒（南京建成生物有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 體重的測量 測定子代雄性大鼠生后第4周至第10周的體重。

1.3.2 血清中酶活性的測定 將子代雄性大鼠腹主動脈血放置4 h，然后3 500～4 000 r/min離心15 min，取上清進行后續(xù)實驗。使用MDA、SOD、CAT、H2O2試劑盒測定 MDA、SOD、CAT、H2O2，按照試劑盒說明書進行檢測。

1.3.3 肛殖距及各臟器系數(shù)的測定 測量子代雄性大鼠的肛殖距。準確稱量大鼠體重和各臟器重量，并進行計算。例如睪丸臟器系數(shù)=雙側(cè)睪丸濕重（g）/體重（100 g）。

1.3.4 精子數(shù)、精子活動百分數(shù)的測定 取子代雄性大鼠附睪，將其置于1 ml生理鹽水中，用眼科剪剪碎，制成精子懸液滴加到精子計數(shù)板，光學(xué)顯微鏡下計算精子數(shù)和和精子活動百分數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，符合正態(tài)分布數(shù)據(jù)的組間比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，方差齊時用LSD進行兩兩比較；若方差不齊，則采用Dunnett's T3檢驗；若不滿足正態(tài)性時，則采用非參數(shù)檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 孕期BPA暴露對子代雄性大鼠體重的影響 各劑量BPA暴露組子代雄性大鼠體重與對照組比較，體重均有一定程度的降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 孕期BPA暴露對子代雄性大鼠體重的影響（x±s，g）

2.2 孕期BPA暴露對子代雄性大鼠臟器系數(shù)的影響 與對照組比較，各劑量BPA暴露組子代雄性大鼠的肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)及睪丸系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；附睪系數(shù)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量BPA暴露組和高劑量BPA暴露組子代雄性大鼠附睪系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 孕期BPA暴露對子代雄性大鼠臟器系數(shù)的影響（x±s，g/100 g）

2.3 孕期BPA暴露對子代雄性大鼠肛殖距、精子數(shù)等的影響 3組肛殖距比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量BPA暴露組子代雄性大鼠精子數(shù)均低于對照組和低劑量BPA暴露組（P＜0.01）；各劑量BPA暴露組子代雄性大鼠的精子活動百分數(shù)均低于對照組（P＜0.01）。見表3。

表3 孕期BPA暴露對子代大鼠的肛殖距、精子數(shù)、精子活動百分數(shù)的影響（x±s）

2.4 孕期BPA暴露對子代雄性大鼠血清脂質(zhì)過氧化指標的影響 3組子代雄性大鼠血清CAT活性比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；高劑量BPA暴露組血清H2O2含量、MDA含量明顯高于對照組（P＜0.05），且高劑量BPA暴露組血清MDA含量明顯高于低劑量BPA暴露組（P＜0.05）；不同劑量BPA暴露組子代雄性大鼠血清SOD活性均低于對照組（P＜0.05）。見表4。

表3 孕期BPA暴露對子代大鼠血清脂質(zhì)過氧化指標的影響（x±s）

3 討論

BPA作為一種重要的工業(yè)添加劑，全球產(chǎn)量在2011年達到約560萬t/a，中國總產(chǎn)量達到61.6萬t/a［7］。BPA在世界各地環(huán)境中均有檢出，調(diào)查顯示日本全國水境BPA的檢出率為68%，德國飲水中BPA的濃度范圍300 pg/L～2 ng/L，北京市污水系統(tǒng)污染物中BPA的含量高達825 ng/L［8］。BPA能夠通過模擬雌激素活性，DNA甲基化修飾等方式導(dǎo)致生殖系統(tǒng)損傷，這種影響可以發(fā)生在胚胎期、青春期和（或）成年期。生殖系統(tǒng)在發(fā)育期對激素樣活性物質(zhì)特別敏感，此時激素水平的改變則會對生殖系統(tǒng)產(chǎn)生終生的影響。有研究表明早期接觸BPA會長期影響睪丸發(fā)育以及精子的發(fā)生，但其影響機制目前尚不明確［9］。

體重是評估受試毒物暴露對實驗動物一般狀況影響的綜合指標，能較敏感而客觀地反映生物體染毒后的全身營養(yǎng)狀況和整體機能的改變。在周芩［10］的研究中，各染毒組染毒劑量增高，小鼠體重增長量越來越小，高劑量組體重增長量明顯低于對照組。本實驗研究結(jié)果也顯示孕期BPA暴露實驗組子代雄性大鼠的體重明顯低于對照組（P＜0.05），說明孕期BPA暴露對子代雄性大鼠的體重具有一定的影響。與此同時精子數(shù)量一定程度上反映了生物體的生殖能力。化學(xué)物對各級生精細胞生長和發(fā)育產(chǎn)生了毒性作用，這往往是精子數(shù)減少的重要原因。本研究中高劑量BPA（100 mg/kg）孕期暴露能引起子代雄性大鼠精子數(shù)的減少，這一現(xiàn)象可能由于BPA具有透過大鼠血睪屏障的能力，因而干擾大鼠精子的生長和發(fā)育過程，對大鼠的生殖系統(tǒng)產(chǎn)生損傷。精子運動被認為是生育力最重要的指標之一。在Ficsor等［11］的研究中，用絲裂霉素C染毒大鼠后，結(jié)果發(fā)現(xiàn)第1、3、10周給藥后出現(xiàn)精子活動度下降。本研究中，33.3 mg/kg與100 mg/kg BPA孕期暴露可引起子代雄性大鼠精子活動百分數(shù)明顯下降，這可能與BPA造成的精子能量代謝紊亂有關(guān)，也可能與畸形精子數(shù)目增高有關(guān)。在李玉華等［12］的研究中，BPA暴露組與對照組間的生殖系統(tǒng)臟器指數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究中，不同劑量BPA孕期暴露組子代雄性大鼠附睪系數(shù)與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。由于李玉華的研究中BPA染毒劑量設(shè)置為5 μg/kg 、50 μg/kg，遠低于本實驗中低劑量組33.3 mg/kg，雖影響分子機制但附睪系數(shù)并無明顯改變。考慮是BPA染毒時劑量不同造成的影響，導(dǎo)致本實驗中附睪系數(shù)變化明顯。但3組肝臟系數(shù)、腎臟系數(shù)及睪丸系數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

氧化應(yīng)激是外源化學(xué)物對機體損傷的常見形式，孕期BPA暴露影響子代雄性大鼠脂質(zhì)過氧化水平。本研究檢測了脂質(zhì)氧化應(yīng)激過程中MDA、H2O2、抗氧化酶類CAT、SOD等常見氧化產(chǎn)物的變化。本研究中不同劑量BPA暴露組SOD活性降低，機體氧化系統(tǒng)平衡被破壞，保護能力下降。王承敏［13］的研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睪丸支持細胞經(jīng)BPA處理后，高劑量處理組支持細胞內(nèi)SOD活性降低，所有BPA染毒劑量組支持細胞內(nèi)MDA的含量均顯著升高。提示BPA暴露可能破壞生殖系統(tǒng)氧化系統(tǒng)的平衡，造成生殖系統(tǒng)的損傷。本研究結(jié)果同時發(fā)現(xiàn)，100 mg/kg BPA孕期暴露可導(dǎo)致子代雄性大鼠血清MDA、H2O2含量升高，表明孕期BPA暴露對子代雄性大鼠血清H2O2和MDA的含量、SOD的活性產(chǎn)生一定程度的影響。

在馬明月等［14］的研究中，母鼠孕期暴露BPA，與對照組相比，10、50、250 mg/kg BPA暴露組子代雌性大鼠睪酮水平明顯下降（P＜0.05）；50 mg/kg BPA暴露組子代雌性大鼠LH、FSH、E2水平明顯下降（P＜0.05）。提示BPA有可能通過下丘腦-垂體-性腺軸對大鼠生殖系統(tǒng)產(chǎn)生影響。在全超［15］的研究中，孕后期BPA暴露能造成子代雄性SD大鼠內(nèi)分泌紊亂與氧化應(yīng)激，同時抑制睪丸組織內(nèi)Akt/mTOR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，激活線粒體凋亡通路，誘導(dǎo)睪丸組織凋亡，導(dǎo)致大鼠精子質(zhì)量下降。

綜上所述，孕期BPA暴露可損傷子代雄性大鼠生殖系統(tǒng)，對大鼠生長發(fā)育產(chǎn)生一定影響。大量互相矛盾的數(shù)據(jù)存在于低劑量BPA研究中，造成這種現(xiàn)象的原因不僅與暴露方式、暴露劑量、暴露階段等原因有關(guān)，更可能與雄性大鼠體內(nèi)BPA具有高度復(fù)雜的分子作用機制有關(guān)。這種復(fù)雜的機制，導(dǎo)致了實驗結(jié)果呈現(xiàn)多樣性。BPA對雄性生殖系統(tǒng)的影響尚需進一步研究。