早期類風濕關節炎患者甲襞微循環積分與病情活動度及骨質疏松的相關性分析

張磊高照猛徐建于春艷張旗

勝利油田中心醫院風濕免疫科，山東 東營 257034

類風濕關節炎(RA)是一種系統性自身免疫性炎癥性疾病，可導致軟骨及骨質的侵蝕破壞。骨關節受損主要表現為骨侵蝕以及關節周圍和全身的骨質疏松，隨著病程的發展導致椎體或非椎體骨折的危險增加。RA病理研究中發現滑膜增生肥厚及滑膜炎為局部骨侵蝕的主要特征[1]，同時研究發現關節滑膜炎癥形成以前，許多炎癥細胞和介質刺激血管平滑肌增生并遷移至內膜下，在局部形成損害并增加白細胞、血小板對內皮細胞的黏附，促進凝血，誘導產生活性物質，擴血管活性物質釋放減少造成血清成分滲入內皮下，使基底膜、血管壁增厚，造成局部及全身微循環障礙，并又進一步加重炎癥程度[2]。而甲襞微循環檢測作為評估微循環狀態的一種無創性檢查很早便用于包括RA在內的多種風濕性疾病的鑒別診斷[3]，可評價RA微循環狀態。目前國內尚無對于早期RA微循環障礙與骨代謝之間的相關性研究，鑒于此，我們進行該項研究，旨在為RA骨代謝研究探尋新的途徑。

1 材料和方法

1.1 臨床資料及隨訪方法

選擇自2016年5月30日起就診于我院風濕免疫科的早期RA患者60例，所有病例均符合 2010年ACR/EULAR的RA分類標準，病情確定24月以內定為早期RA[4]。詳細詢問并記錄患者姓名、年齡、病程、晨僵時間、生活質量(HAQ)評分、患者疾病總體疼痛VAS評分、關節壓痛指數(TJC)、關節腫脹數(SJC)等臨床資料以及紅細胞沉降率(ESR)、C反應蛋白(CRP)、類風濕因子(RF)、抗環胍氨酸肽(CCP)抗體滴度等實驗室資料。根據疾病活動度評分(DAS)28分為：病情穩定及低活動度組為<3.2分，中度活動度為3.2～5.1分，高度活動為>5.1。排除標準：①長期服用雌激素、雄激素、抗凝劑及影響骨代謝的藥物史；②嚴重腎功能損害、甲狀腺及甲狀旁腺疾病等; ③其他彌漫性CTD、肺間質纖維化、肺動脈高壓、冠心病、高血壓、糖尿病、血栓性疾病、腫瘤性疾病、急慢性感染性疾病、上肢或手嚴重外傷或燒傷；④雙手長期震動工具勞動及長期于高溫或低溫環境者及長期吸煙及飲酒的患者；⑤感染、腫瘤等引起的關節疼痛；⑥3月內曾接受維生素D類似物如阿法骨化醇、骨化三醇、維生素D鈣等治療。

收集同期于本院體檢中心體檢的60名性別、年齡匹配的健康人為對照組，年齡24～71歲，平均(47.6±16.7)歲。其中女性47名，男性13名。

本研究經勝利油田中心醫院倫理委員會批準，并取得受試對象的知情同意。

1.2 資料收集及隨訪

1.3 甲襞微循環檢測

江蘇同人醫療電子科技有限公司TR8000D型微循環檢測儀，編號TR1580D10001，可視微循環檢測鏡單元為SONY公司TR15SXJG001。所有受檢患者于檢查6 h前禁止服用含咖啡因飲料及吸煙，檢查前于室溫20～25 ℃檢查室內休息15～20 min。檢查取患者左手環指，并放置于心臟水平位置，滴松節油0.2 mL到待檢指甲襞處，需要時用玻璃棒涂抹均勻。用可視甲襞微循環檢測鏡直接觀察甲襞微循環，避免按壓甲床，2名獨立調查員共同協作截取圖像并測量有關數據，最后由內置程序計算積分，同時參照田牛[7]加權積分方法，將患者分為輕度(加權積分<4分)、中度(4～8分)、重度(>8分)三組。

1.4 血清VEGF、25(OH)D檢測

抽取研究對象空腹靜脈血3 mL左右，留取血清并于-80 ℃凍存。采用ELISA法測定血清VEGF。采用羅氏公司E-601型號的化學發光儀，試劑盒為25(OH)D檢測試劑盒(產品標準：YZB/GER4825.2011)，所有檢測步驟按照說明書進行操作。其中25(OH)D<20 ng/mL為維生素D缺乏，20 ng/mL～30 ng/mL為維生素D不足，30 ng/mL≤25(OH)D<100 ng/mL為維生素D理想水平。

1.5 骨密度檢測

應用雙能X線吸收儀(DXA，美國Hologic QDR 2000型)測定正位脊柱腰椎(L1～4)前后位及左側股骨近端各部位包括股骨頸、Ward三角區、大粗隆的骨密度。根據2007年國際測量學會(ISCD)要求[8]：以L1～4或股骨頸及全髖部位骨密度最低值診斷骨質疏松。臨床對于絕經后婦女或者老年男性(年齡>60歲)要求使用T值，未絕經婦女及年輕男性要求使用Z值。以T值(或Z值)≥-1為骨量正常，以-2.5

1.6 隨訪情況

所有患者基線收集相關資料結束后給予來氟米特(蘇州長征-欣凱制藥有限公司)10～20 mg/d及塞來昔布(輝瑞制藥有限公司)200～400 mg/d治療。對于維生素D缺乏的患者給予阿法骨化醇(上海信誼延安藥業有限公司)0.5μg/d，2周后再次測量記錄DAS28積分、血清25(OH)D水平及甲襞微循環積分。

1.7 統計學處理

2 結果

2.1 甲襞微循環調查者間一致性描述

本研究采用甲襞微循環計算機加權積分，操作過程需人工測量相關數據，因此對2名調查員間進行一致性檢驗。對于60名患者，2名調查員用同一甲襞微循環檢測儀分別獨立測量并記錄有關參數，并進行Kappa一致性檢驗，結果見表1, 提示調查員間一致性較高。

圖1 甲襞微循環積分與血清25(OH)D水平相關分析(r=-0.593, P<0.001)Fig.1 Regression analysis between nailfold capillaroscopy scores and 25(OH)D3 level(r=-0.593, P<0.001)

Table1Kappa test between investigators engaged in nailfold capillaroscopy

ItemKappa95%CIStrength毛細血管密度0.8250.70～0.9588.3%毛細血管寬度及長度0.7500.61～0.8783.3%動靜脈分支直徑0.8370.60～0.8990.0%毛細血管內徑0.8000.67～0.9386.6%毛細血管袢直徑0.8490.73～0.9691.0%乳頭下靜脈叢可視度0.7750.64～0.9185.1%

2.2 研究人群按甲襞微循環積分分組的一般資料

60名RA患者納入觀察隊列，患者病程(10.0±4.2)月，女性48例，男性12 例；年齡21～72 歲，平均(46.5±11.5)歲。按甲襞微循環積分分組后，三組在年齡、性別、病程、RF、CCP、ANA、VEGF、關節超聲積分方面差異無統計學意義，重度組ESR、CRP、DAS28積分、微循環積分、骨量下降及骨質疏松發生率高于輕度組，見表2。

表2 不同甲襞微循環積分分組患者的一般資料比較Table 2 Comparison of general data among patients in mild, moderate, and severe group

2.3 早期RA組和健康對照組甲襞微循環積分比較

表3早期RA患者組與健康對照組的甲襞微循環積分比較

Table3Comparison of nailfold capillaroscopy scores between early RA group and control group

組別微循環積分微循環異常分級輕度(n)中度(n)重度(n)RA組6.13±1.92123414對照組4.70±1.5443143t/χ2值3.17432.92P值0.018<0.001

RA患者甲襞微循環積分水平高于健康對照組，差異有統計學意義[(6.13±1.92)與(4.70±1.54)，t=3.174，P=0.018]。60例RA患者重度甲襞微循環異常有14例(23.3%)，中度異常34例(56.7%)，輕度異常12例(20.0%)；60名健康對照者重度甲襞微循環3例(5.0%)，中度異常14例(23.3%)，輕度異常43例(71.7%)，RA組和對照組甲襞微循環積分分布比較，差異有統計學意義(χ2=32.92,P<0.001), 見表3。

2.4 甲襞微循環積分與臨床及病情活動度的關系

甲襞微循環積分分別與RA患者DAS28積分、ESR、CRP、抗CCP抗體滴度相關(r=0.515、 0.579、0.422、0.473,P均<0.05) 同時，甲襞微循環積分在不同疾病活動度的RA患者中表達差異有統計學意義(F=60.63，P<0.05)，病情為高度活動組(21例)的RA患者甲襞微循環積分(6.94±1.43)高于中度活動組(21例, 5.48±0.83)和輕度活動組(18例，3.16±0.79)，差異具有統計學意義(P<0.05)。以DAS28為因變量，甲襞微循環積分、抗CCP抗體、CRP等為自變量，多元線性回歸分析進一步提示甲襞微循環積分增高是疾病活動的危險因素(b=0.54，P<0.05)，見表4。

表4早期RA患者病情活動度相關因素的多元線性回歸

Table4Multiple linear regression analysis of the associated factors of disease activity in patients with early RA

變量β95%CISEtP抗CCP抗體0.0060.001,0.0110.0032.4510.017血沉0.0250.009,0.0410.0083.1830.002微循環積分0.3760.084,0.6690.1462.5740.013

2.5 甲襞微循環積分與血清25(OH)D、VEGF的關系

甲襞微循環重度異常組25(OH)D水平(13.0±4.1)ng/mL，中度、輕度組分別為(18.0±5.1)、(24.0±3.8)，三組間兩兩比較，差異均有統計學意義(P均<0.05)。Pearson相關分析顯示甲襞微循環積分與25(OH)D水平呈負相關(r=-0.593,P<0.001), 見圖1。甲襞微循環重度異常組VEGF水平(130±27)pg/mL，中度、輕度組分別為(110±35)pg/mL、(106±38)pg/mL，雖然VEGF水平隨甲襞微循環積分增加有增高趨勢，但差異無統計學意義(P=0.061)。VEGF水平同樣隨25(OH)D減低表現出增高的趨勢，但差異也無統計學意義(P=0.702)。

基線時60例患者中維生素D缺乏34例(56.7%), 該34例患者DAS28評分為(5.14±1.63)，25(OH)D水平(14.0±3.4)ng/mL，甲襞微循環積分(6.68±2.06)；其中甲襞微循環積分輕度者1例(占2.9%)，積分為2.50；中度者20例(占58.8%)，平均(5.49±1.28)；重度者13例(占38.3)，平均(8.84±0.45)。34例患者均接受阿法骨化醇0.5μg/d口服，2周后隨訪復查DAS28為(5.09±1.79)，較前相比差異無統計學意義(t=1.339,P=0.190)，25(OH)D水平(18.0±4.2)ng/mL較前相比增高，具有統計學意義(t=-11.913,P<0.001)。而甲襞微循環積分平均(4.62±1.69)較前相比下降，差異具有統計學意義(t=14.742,P<0.001)；具體分布如下：輕度5例(占14.7%)，平均(3.38±0.56)，中度22例(64.7%)，平均(5.82±1.38)；重度7例(20.6%)，平均(8.59±0.44)，較前相比差異也具有統計學意義(Z=-2.605,P=0.009)。

2.6 甲襞微循環積分與骨密度的關系

60例RA患者做了骨密度檢測，其中骨量正常組16例(26.7%)，平均年齡(32.19±5.55)歲；骨量減少組20例(33.3%)，平均年齡(45.75±5.50)歲；骨量疏松組24例(40.0%)，平均年齡(59.08±5.06)歲，3組間比較差異有統計學意義(F=123.43，P<0.05)。骨質疏松組、骨量減少組和骨量正常組甲襞微循環積分依次為(8.59±0.57)，(5.79±0.93)，(3.06±0.90)，3組比較差異均有統計學意義(F=236.23，P均<0.05)。以骨密度分組(骨質疏松組=1，非骨質疏松組=0)為因變量，60例RA患者的年齡，病程，甲襞微循環積分、DAS28、25(OH)D水平等為協變量，二元Logistic回歸分析發現25(OH)D是RA患者骨質疏松的保護因素(OR=0.650，P=0.022)，甲襞微循環、年齡和DAS28是骨質疏松的危險因素(OR分別為1.632、1.257和，1.506，P均<0.05)，見表5。

表5早期RA患者骨質疏松影響因素的回歸分析

Table5Multivariate Logistic repression analysis of the associated factors of osteoporosis in early RA patients

變量βSEOR95%CIPAge0.2290.1051.2571.023, 1.5440.015Duration0.3190.1581.4090.918, 2.4160.085ESR0.0120.0371.0160.895, 1.1230.786ACPA0.0110.0161.0110.980, 1.0440.480DAS28 Scores0.3240.2191.5060.958, 2.1470.04725(OH)D-0.8700.3560.6500.439, 0.9610.022VEGF0.0080.0301.0080.956, 1.0680.786Nailfold capillarosocy Scores0.1740.0661.6321.044, 2.5690.003

Note：β: Multiple regression unstandardized coefficient; SE: standard error

3 討論

早期RA的病理改變以關節滑膜炎為主，滑膜增厚向軟骨邊緣部分擴展形成血管翳，進而侵蝕骨關節軟骨，使之變薄和破壞，并進一步侵蝕軟骨下骨質，同時累及關節周圍支持組織，導致關節功能喪失。這一過程中主要表現為骨吸收增加和骨形成受損，這種不平衡的骨改建可發生在軟骨下和關節周圍骨關節，導致侵蝕和關節周圍骨質疏松，甚至發生在軸向及四肢骨骼，導致全身性骨質疏松。我們研究發現早期RA病情活動是導致骨質疏松發生的危險因素(OR=1.506,P=0.047), 與國內胡晶等[9]發現一致。在RA發生發展的過程中，由炎癥因子、自身抗體等介導的血管及血管內皮細胞的炎癥發揮重要作用，可以導致血管系統在內的多組織器官受累[10]。Foster等[11]研究發現，在未確診RA的極早期炎性關節病患者中存在明顯的微血管功能障礙及血管內皮細胞損傷的證據，但未發現這些表現與ESR、CRP等炎癥標志物密切相關，提示多種機制參與下，關節炎癥早期便可出現血管內皮細胞及功能損傷，進而出現微循環功能障礙。國外研究[12]提示RA相關血管內皮功能障礙與一氧化氮(NO)生成減少、內皮NO合酶的表達及活性減低等相關；國內石朝云等[13]等研究發現RA患者血清和關節液中的內皮素-1(endothelin-1)水平均高于健康人，或參與了血管收縮及血管功能障礙的發生[14]；Herbrig等[15]研究發現低度病情活動的RA患者中同樣存在血管內皮功能障礙。Bergholm等[16]最早于2002年報道了早期RA患者肱動脈對乙酰膽堿的反應性減低，提示存在血管內皮功能障礙，而后續的多項研究[17-21]也證實無論在極早期關節炎或確診的RA患者中，還是在低病情活動或高度活動的RA患者中均存在血管內皮功能障礙，包括微循環系統在內。

RA患者出現微循環功能障礙、毛細血管通透性改變以及血管內皮細胞和細胞外基質連接異常，進而出現真皮乳頭處毛細血管結構和形狀的異常，這種形態特征和微循環功能狀態可以通過甲襞微循環鏡檢測到[3]。甲襞微循環鏡作為一種無創性影像學技術，用于檢測甲襞區域微循環狀態，并已被證明在RA的鑒別診斷中有幫助[22]。本研究發現23.3%(14例)的早期RA患者存在重度甲襞微循環異常，56.7%(34例)的患者存在中度異常，平均甲襞微循環積分(6.13±1.92)，顯著高于健康對照組(4.70±1.54)(t=3.174，P<0.05)。高度活動組(21例)(6.94±1.43)的RA患者甲襞微循環積分高于中度活動組(21例, 5.48±0.83)和輕度活動組(18例，3.16±0.79)，差異具有統計學意義(P<0.05)。Lambova等[23]研究發現RA患者的甲襞微循環檢查中有69%乳頭下靜脈叢突出和58%的毛細血管細長改變，而30.6%合并雷諾現象的RA患者中，毛細血管袢動靜脈分支的直徑較未合并雷諾現象及對照組有顯著擴張。本研究中發現早期RA患者甲襞微循環障礙表現為毛細血管分布紊亂，毛細血管迂曲，部分可見血管翳，毛細血管畸形以及微血管內血流緩慢等，將來可進一步可完善相關研究。

我們研究中發現部分RA患者甲襞微循環中毛細血管增生、迂曲，部分可見血管翳，提示存在新生血管形成。Koch[24]研究證實在高度活躍的RA中，新生血管的形成占有重要的地位，特別是在的疾病的早期階段，新形成的血管可以維持慢性炎癥狀態，輸送炎癥細胞至滑膜炎癥部位，并給血管翳供應養分和氧氣。RA血管生成介質[25]受到VEGF等嚴格調控，VEGF能增加毛細血管直徑，促進毛細血管增生[26]，同時能增加血管通透性，引起毛細血管開放，導致細胞間連接和細胞間隙結構破壞[27]，以上提示VEGF與RA微循環障礙密切相關，同時也部分解釋了甲襞微循環中毛細血管增生的現象。我們發現甲襞微循環重度異常組VEGF水平(130±27)pg/mL高于中度組(110±35)pg/mL、輕度組(106±38)pg/mL，雖然VEGF水平隨甲襞微循環積分增加有增高趨勢，但差異無統計學意義(P=0.061)。Lee等[28]發現在RA患者血清和滑膜中VEGF水平無相關性， RA血管形成是由于局部性還是全身性因素驅動并不確定，VEGF參與骨代謝的復雜機制或許解釋了這一點。

維生素D缺乏普遍存在于RA患者中[29]。維生素D通過與細胞內特異性的維生素D受體(VDR)結合，不僅可以調節骨鈣磷代謝改善骨質疏松[30]，同時作為一種類激素物質可以通過樹突狀細胞和T、B淋巴細胞抑制炎癥細胞因子如白細胞介素-17等的合成，促進抗炎細胞因子的分泌，參與RA患者免疫調節。Corrado[31]發現在堿性環境中，骨關節炎的成骨細胞較正常及骨質疏松者表達更高水平的VEGF，而在維生素D3存在情況下，卻沒有這種差異，維生素D3顯著增強正常和病理性成骨細胞VEGF的表達。維生素D缺乏與血流介導的血管擴張以及頸動脈內中膜厚度獨立相關，維生素D缺乏的RA患者血清25(OH)D水平與微血管功能正相關，因此維持正常的血清維生素D水平對于RA患者血管功能具有重要作用[32]。Corretti等[33]研究發現RA中低水平的血清25(OH)D與血流介導擴張反應(FMD)減低相關，而FMD可用于評價慢性炎癥疾病的血管內皮功能[34]。Ranganathan等[32]研究證實維生素D對血管內皮功能的保護作用可能是影響Th17功能，阻止IL-17介導的炎癥反應，進而改善微循環障礙，但是這種對血管內皮功能的保護性生物學效應，似乎僅在20ng/mL以下發揮作用，高于此閾值水平時不能改善內皮功能。我們研究發現甲襞微循環積分越高的RA患者的血清25(OH)D水平越低，Pearson相關分析顯示二者呈負相關(r=-0.593,P<0.05)。對于維生素D缺乏的34例患者給予補充阿法骨化醇(0.5μg/d)治療后，甲襞微循環積分(4.62±1.69)較治療前(6.68±2.06)下降，差異具有統計學意義(t=14.742,P<0.001)，提示維生素D潛在的微血管保護作用，但仍需將來大樣本前瞻性研究證實。

RA患者的微循環障礙使骨組織、胃腸道、腎臟、 性腺等與骨代謝密切相關臟器缺血缺氧，使鈣的吸收與運輸不良，雌激素、睪酮、1,25-(OH)2D3產生和釋放減少，影響鈣鹽吸收，促進和加重骨質疏松的發生；骨質疏松癥患者的骨代謝與內分泌代謝紊亂同時又影響了紅細胞的流變性，使紅細胞的聚集性、剛性增加，變形性減小，血液粘度增加，更容易導致血栓形成與微循環障礙。骨髓微環境主要由骨髓基質、微血管、成骨細胞、破骨細胞、脂肪細胞、造血細胞及相關細胞因子等組成，是骨吸收和骨重建的重要場所[35]，骨髓微環境中脂肪細胞、微循環灌注變化與骨質疏松的發生發展密切相關。眭承志等[36]研究發現骨鈣素N-端中分子片段(N-MID)、I型膠原氨基端前肽(PINP)均與甲襞微循環評分存在顯著正相關(P均<0.01),證實圍絕經期女性骨代謝異常與“血瘀”關系密切。本研究發現，RA患者按骨密度分組后，骨質疏松組、骨量減少組和骨量正常組甲襞微循環積分依次為(8.59±0.57)，(5.79±0.93)，(3.06±0.90)，3組比較差異均有統計學意義(F=236.23，P均<0.05)，Logistic回歸分析發現甲襞微循環是RA患者發生骨質疏松的危險因素(OR=1.632，P=0.033)。

本研究同樣存在一定局限性，如受檢查者的經驗、條件、方法的差異會對微循環的量化產生影響；隨患者年齡的增長、器官組織的老化，毛細血管前因素如動脈硬化、心功能等及血流的管內因素如血液黏度、血脂；血管周圍結締組織的變化等均會對微循環產生較大影響；另外甲襞微循環鏡檢查只能看到毛細血管，部分能看到毛細血管叢，不能觀察到細動脈、細靜脈，對局部整體循環判斷有局限性；非甾體抗炎藥等藥物也可能會影響血管內皮細胞功能，在某種程度上影響微循環功能[37]。

最后，早期RA患者存在甲襞微循環障礙，微循環功能障礙參與了RA骨質疏松的發生、發展。對于那些存在維生素D缺乏的RA患者，適當給予活性維生素D治療或許有助于微循環功能的改善。