熒光定量PCR檢測非小細胞肺癌組織EGFR基因第19、21外顯子突變及臨床意義*

黃 剛，劉聯斌，劉 彎，林 煒，周小娟（贛州市腫瘤醫院檢驗科，江西341000）

肺癌是全世界范圍內發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，在我國是影響居民健康的主要惡性腫瘤，且肺癌的發病和死亡率逐年升高，其中非小細胞肺癌（NSCLC）占全部肺癌的80%左右[1]。早期NSCLC患者可以通過手術進行有效治療，但只有約30%的NSCLC患者有手術機會[2]。

目前，在臨床應用較為普遍的是以表皮生長因子受體（EGFR）為靶點的靶向治療，靶向治療效果與EGFR基因突變有關。目前包括美國國立綜合癌癥網絡（NCCN）、歐洲臨床腫瘤學會（ESMO）及中國肺癌EGFR基因突變檢測專家共識等指南均一致建議，肺癌患者應常規進行EGFR檢測，可見EGFR基因突變檢測的重要性[3]。研究發現，NSCLC患者EGFR突變表現為1個或1段堿基的缺失、插入及堿基替換引起的錯義突變，可以引起酪氨酸激酶的活性增強[4]。EGFR基因突變均發生在酪氨酸激酶域腺苷三磷酸（ATP）結合域附近（第18～21外顯子），NSCLC患者EGFR基因中酪氨酸激酶區域的5種常見突變類型見表1，其中第18和第20外顯子突變為耐藥性突變，第19和第21外顯子突變為活化性突變。多項研究表明，實時熒光定量PCR檢測EGFR基因突變較其他方法具有簡單、快速、靈敏等特點[5?6]。周建婭等[7]研究顯示，肺癌患者 EGFR 基因突變與肺癌分型、吸煙史、性別等因素密切相關。本研究采用Taqman探針實時熒光定量PCR法檢測NSCLC患者組織EGFR基因突變情況，并分析其臨床意義。現報道如下。

表1 NSCLC患者EGFR基因中酪氨酸激酶區域的5種常見突變類型

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 標本來源 收集本院2015年1月至2016年6月NSCLC患者 156例，其中男 86例，女 70例；年齡42～68歲，平均58歲；腺癌89例，鱗癌57例，腺鱗癌6例，大細胞癌4例。經手術切除后的腫瘤組織標本立即浸泡于液氮中，置于-80℃冰箱中冷凍保存。石蠟標本用10%甲醛固定，常規石蠟包埋封存。

1.1.2 試劑與儀器 EGFR基因突變檢測試劑盒由廣州達安基因檢測公司提供，實時熒光定量PCR檢測儀為美國ABI7500。

1.2 方法 應用Taqman探針技術分析NSCLC組織中EGFR外顯子第19、21外顯子突變。每次試驗設定空白對照及陰性、陽性對照孔。反應循環參數為：50℃2 min、95℃10 min，以激活 DNA 聚合酶；95℃15 s，62℃1 min，循環40次。以無模板對照擴增曲線的最高點為準設定閾值。沒有出現擴增曲線或Ct=0的樣本為陰性樣本；出現擴增曲線且Ct≤34.0的樣本為陽性樣本；34.0＜Ct≤38.0的樣本為可疑陽性樣本，需重復檢測。

1.3 統計學處理 應用SPSS17.0統計軟件進行數據分析，計數資料以率或構成比表示，采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 Taqman探針實時熒光定量PCR法檢測 156例NSCLC患者癌組織中 51例（32.7%）存在 EGFR酪氨酸結合域的基因突變，其中第21外顯子替代突變率為 37.3%（19∕51），第 19外顯子缺失突變率為62.7%（32∕51）。del?E746?A750 突變占外顯子 19 突變的62.5%（20∕32），L858R 突變占外顯子 21突變的 78.9%（15∕19）。

2.2 EGFR基因突變與臨床病理的關系 腺癌患者發生 EGFR 基因突變率[41.6%（37∕89）]高于鱗癌[22.8%（13∕57）]、腺鱗癌[16.7%（1∕6）]，差異有統計學意義（P＜0.05）；女性患者突變率[50.0%（35∕70）]高于男性[18.6%（16∕86）]，不吸煙者突變率[42.9%（42∕98）]高于吸煙者[15.5%（9∕58）]，差異均有統計學意義（P＜0.01）。見表2。

表2 EGFR基因突變與臨床病理的關系

3 討 論

目前常用基因突變檢測的方法累計大約有20余種，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）、雜合雙鏈分析法（HA）、化學切割錯配（CCM）、單鏈構象多態性分析（SSCP）、DNA測序、變性的高效液相色譜檢測（DHPLC）、DNA芯片技術、等位基因特異性寡核苷酸片段分析（ASO）、限制性片段長度多態性、TaqMan探針實時熒光定量PCR法、焦磷酸測序法、蝎形探針擴增阻滯突變系統（ARMS）等，每種檢測方法各有優點。實時熒光定量PCR法與DNA測序法相比具有靈敏、簡單、快速等特點，隨著探針技術的日趨成熟，在臨床基因診斷和大規模人群篩查中具有良好前景和重要價值[8]。

本研究運用實時熒光定量PCR法檢測NSCLC組織EGFR基因突變情況發現，NSCLC患者存在的EGFR基因突變以第19、21外顯子突變為主，其中以腺癌、女性、不吸煙患者更為常見，這與周彩存等[9]的報道較為一致。目前，我國肺癌患者EGFR突變受檢率相對于發達國家仍較低，本研究能夠為臨床合理選擇治療方案提供數據支持。特別是對EGFR敏感突變者，吉非替尼和厄洛替尼這2種表皮生長因子受體?酪氨酸激酶抑制劑（EGFR?TKIs）已經得到廣泛認可并已用于晚期NSCLC的治療[10]。因此，掌握肺癌患者EGFR基因突變情況及特點并結合臨床病理特征，對于患者接受精準靶向治療具有重要意義。