紅肉火龍果采后病原菌分離鑒定與植物精油抑菌研究

劉瑞玲 郜海燕 陳杭君 房祥軍 吳偉杰

(1.浙江省農業科學院食品科學研究所， 杭州 310021； 2.農業部果品產后處理重點實驗室， 杭州 310021； 3.浙江省果蔬保鮮與加工技術研究重點實驗室， 杭州 310021； 4.中國輕工業果蔬保鮮與加工重點實驗室， 杭州 310021)

0 引言

火龍果是仙人掌科量天尺屬，屬典型的熱帶植物。火龍果風味獨特，含有豐富的維生素、甜菜苷以及水溶性膳食纖維[1]，具有降血脂、養顏減肥、抗氧化和防衰老等功效[2-4]。按果皮和果肉顏色，火龍果可分為紅皮白肉、紅皮紅肉、黃皮白肉3類[5]。近年來，隨著溫室技術的發展，浙江地區已有一定規模的種植面積，其中以紅肉火龍果為主。紅肉火龍果色澤鮮艷、肉質細嫩、鮮食品質較好，富含甜菜堿，營養價值高。但其含水率高、果皮較薄，采后極易失水皺縮或腐爛，使其耐貯藏性比白肉火龍果差。火龍果采后病害將造成巨大經濟損失，已成為制約浙江種植區產業發展的主要問題。

研究表明，火龍果采后主要病害是炭疽病、黑斑病和軟腐病等[6]。有關火龍果果實采后病原菌分離鑒定的研究已有一些報道，MA等[7]研究表明，鐮刀菌(Fusariumspp.)和鏈格孢菌(Alternariaspp.)是上海市進口火龍果的主要采后病原菌。GUO等[8]鑒定，引起云南省火龍果果實炭疽病的主要病害為平頭炭疽菌(C.truncatum)。姚昇華等[9]認為，仙人掌平臍蠕孢(Bipolariscactivora)是引起越南紅心火龍果黑腐病的主要致病菌。然而，浙江地區主栽火龍果品種的采后病原菌種類和防治方法未見相關報道。因此，分離和鑒定浙江紅肉火龍果采后主要致病菌，對減少采后物流損失、增加經濟效益具有重要意義。

目前，國內外火龍果保鮮的方法主要有低溫貯藏、減壓貯藏、熱處理、輻照處理等物理保鮮技術，以及使用1-甲基環丙烯(1-methylcyclopropene，1-MCP)、CaCl2、殼聚糖等防腐保鮮劑的化學保鮮技術[6, 10-13]。化學殺菌劑雖是防治果蔬采后病害的重要手段，但具有殘留量高、污染環境、易使病原菌產生抗藥性等負面效應，不宜長期使用。植物精油以其安全、低毒、高效、環境友好等特點作為化學保鮮劑的良好替代品，是一種極具潛力的天然殺菌劑[14-15]。植物精油(如香芹酚、肉桂醛、麝香草酚、AITC等)對多種果蔬釆后病原菌有較強的抑制作用，能夠減緩采后病害的發生[16-17]。植物精油對火龍果采后病原菌抑制效果研究，至今未見文獻報道。

本文對浙江地區紅肉火龍果果實采后低溫貯藏過程中的病原菌進行分離純化，并對其進行形態學和分子生物學鑒定。同時，采用體外直接接觸和體外熏蒸試驗，比較6種植物精油對火龍果采后主要病原菌的抑菌效果，以篩選出抑菌效果較好的精油，旨在為火龍果采后病害控制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

果實：紅肉火龍果，2017年7月21日采自浙江省杭州市火龍果基地，并用保鮮車24 h內運至實驗室。挑選顏色均勻、無病蟲害、無機械損傷的果實于(7±1)℃冷庫中貯藏，待自然發病后進行病原菌的分離鑒定。

試劑：肉桂精油、百里香精油、香芹酚精油、丁香精油、羅勒精油和芳樟醇均為單方精油，購自江西金源天然香料有限公司；無水乙醇、三氯甲烷、乙酸乙酯、葡萄糖、瓊脂粉，均為分析純，購于浙江常青化工廠；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)、馬鈴薯葡萄糖肉湯培養基(PDB)購于上海盛思生物科技有限公司；DNA植物kit基因組織提取試劑盒購于TaKaRa Bio有限公司；SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購于上海生工生物工程有限公司。

儀器： MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌器(松下健康醫療器械株式會社)；臺式高速低溫冷凍離心機(美國Thermo公司)；DYY-11型電泳儀電源和DYCP-31F型電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；Peltier Thermal Cycler MG48型普通PCR儀(美國BioRad公司)；WD-9413C型凝膠成像分析系統(北京六一生物科技有限公司)；MJX-160B-Z型霉菌培養箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠)。

1.2 試驗方法

1.2.1病原菌的分離純化

將自然發病的火龍果果實按病癥分組。首先用滅菌的手術刀在病健交界處切取約3 mm的組織塊，經75%酒精表面消毒30 s，用無菌水清洗3次，置于PDA培養基平板上，每一病癥組5個平板，于25℃恒溫培養箱中暗培養。待菌落直徑生長至1～3 cm時，用滅菌的接種針挑取菌落邊緣的菌絲，置于新的PDA培養基，于25℃恒溫培養箱中暗培養，重復上述操作3～5次，直至獲得純培養物。觀察記錄菌落形態學特征，并對病原菌孢子和菌絲進行顯微形態觀察、拍照。將純化后病原菌接種PDA培養基上，培養一段時間后，觀察菌落培養性狀，包括菌落的形狀和顏色；挑取病原菌制作載玻片，鏡檢并觀察分生孢子的類型、形狀、大小和色澤等。

本試驗分離的菌均為真菌，根據各致病菌株PDA培養基上的菌落形態、菌絲和孢子的特征，參照文獻[18]進行鑒定。

1.2.2病原菌的致病性檢測

按照柯赫法則進行致病性檢測。采用無菌水洗脫純化培養的菌株，收集孢子，利用血球計數板配制成孢子濃度為105CFU/mL的懸浮液。挑選健康火龍果果實，先用清水洗凈，再用75%乙醇對果實表面進行消毒，然后用2%的次氯酸鈉浸泡2 min后，再用無菌水沖洗2遍，晾干備用。接種時用消毒接種針在果實赤道部刺傷(直徑約3 mm，深度約4 mm)，分別接種10 μL孢子懸浮液，以接種無菌水的果實作為對照。將以上處理果實放置于尺寸(長×寬×高)400 mm×300 mm×150 mm的塑料筐中，貯藏于25℃，保持相對濕度約95%。定期觀察發病情況，顯現病癥后再次分離鑒定。將分離出的菌株與所接菌株的菌落形態及菌絲形態進行比較，以判斷是否一致。

1.2.3病原菌分子生物學鑒定

(1)病原菌基因組DNA提取

以分離得到的病原菌為材料，挑取少量菌絲，轉接到50 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基(PDB)培養液中，25℃、150 r/min培養4～5 d后，用無菌濾紙過濾獲得菌絲體，再用無菌水沖洗3～5次，收集菌絲，采用改良的CTAB法提取病原菌基因組DNA[19]。

(2)病原菌rDNA-ITS序列擴增

采用真菌核糖體rDNA轉錄間隔區(ITS)的通用引物ITS1和ITS4[20]，對提取的基因組DNA進行PCR擴增，序列如下：ITS1，5′-TCCGTAGGTGAACC TGCGC-3′；ITS4，5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反應體系(20 μL)：雙蒸水7.4 μL、2×ES Taq Master Mix 10 μL、ITS1(10 μmol/L)0.8 μL、ITS4(10 μmol/L)0.8 μL、模板DNA 1 μL。PCR反應程序：94℃預變性3 min；94℃變性30 s、53℃退火1 min、72℃延伸1 min，35個循環，72℃延伸10 min。4℃下保存。

上述擴增產物經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，切下凝膠中的目的片段，用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(天根生化科技有限公司)進行目的片段回收。回收的DNA片段送生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

(3)病原菌18S rDNA序列分析及進化樹構建

測序結果經BLAST與NCBI數據庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已知序列進行同源性比較，根據同源性比較結果，結合形態學特征，鑒定出病原菌。同時，選取與病原菌ITS序列同源性高的序列，使用MEGA 5.1軟件[21]中的Neighbor-Joining(NJ)方法構建系統發育樹，并用Bootstrap進行自舉檢驗，500次重復。

1.2.4植物精油對病原菌的抑制效果

(1)體外直接接觸法

將精油分別溶于10%吐溫-20中充分乳化。待融化的PDA培養基冷卻到50℃左右，加入一定體積的精油懸浮液，充分振蕩混合后倒平板，使平板終濃度(體積比)為125、250、500、1 000、2 000 μL/L。以不添加植物精油的培養基平板為對照。用無菌打孔器在培養7 d的病原菌平板上打取直徑為6 mm菌塊放在PDA平板(直徑90 mm)中央。置于28℃生化培養箱中培養6 d，觀察抑菌效果。采用十字交叉法測量菌落直徑并計算抑制率。每個濃度梯度3個平板，試驗重復3次。以抑制率100%的最低精油濃度為其最低抑菌濃度(MIC)。抑制率計算公式為

式中dC——對照菌落直徑, mm

dE——處理菌落直徑, mm

(2)體外濾紙熏蒸法

用無菌打孔器在培養7 d的病原菌平板上打取直徑為6 mm菌塊放在PDA平板(直徑90 mm)中央。將平板倒置，取一片直徑為6 mm的無菌濾紙片置于皿蓋中央。分別吸取1、2、3、4、5 μL的精油滴于濾紙片上，以濾紙片上不添加精油的平板為對照。封口膜密封后，置于28℃生化培養箱中培養7 d，觀察抑菌效果。采用十字交叉法測量菌落直徑并計算抑制率。每個濃度梯度3個平板，試驗重復3次。

(3)活體抑菌試驗

火龍果用75%酒精進行表面消毒，晾干后，分別噴灑配制好的鐮刀菌和炭疽菌孢子懸浮液(孢子濃度105CFU/mL)，分別采用精油(25 μL/L)進行密閉熏蒸處理。置于4℃貯藏，每隔4 d觀察火龍果腐爛情況，并計算其腐爛率。每個處理重復2次。

1.3 數據分析

采用SPSS 19.0對數據統計分析，采用Duncan’s多重比較進行顯著性分析，p<0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結果與分析

2.1 病原菌分離純化結果

根據分離獲得的真菌形態特征和培養性狀，在罹病紅肉火龍果果實上分離到6個真菌菌株，將其標記為HS1、HS2、HS3、HS4、HS5和HS6。將分離得到的菌株，依照柯赫氏法則進行回接驗證，其中只有HS3和HS6兩株菌株不同程度地導致果實發病。在PDA培養基上的菌落形態如圖1所示：HS3菌落圓形，氣生菌絲初為白色后為橘黃色，高而疏松，絨狀，棉絮狀；HS6菌落圓形，絨毛狀，初期灰白色，后期為深灰色。菌落表面分散黑色小顆粒即分生孢子，培養后期出現橘紅色孢子堆。通過顯微鏡觀察發現，HS3大型分生孢子短，中等偏窄，兩端稍尖，頂細胞彎曲，多數單個隔膜，小孢子呈橢圓形、新月形，無色透明；HS6分生孢子呈長橢圓形或一端稍窄短棒狀，無色，單胞，內含數個油球(圖1)。

圖1 火龍果貯藏期發病果實病害癥狀、分離菌株 菌落特征和孢子形態 Fig.1 Diseases symptom on pitaya fruit and morphology characteristics of colonies and spores of isolated strains

根據菌落特征和孢子形態，通過與真菌鑒定手冊所描述的形態比對，可將編號為HS3和HS6的真菌菌株初步鑒定為鐮刀菌和炭疽菌。為了進一步鑒定這些分離到的真菌，利用PCR方法對病原菌基因組DNA進行ITS鑒定。

2.2 病原菌18S rDNA-ITS序列和系統發育樹分析

以病原菌基因組DNA為模板，采用rDNA的ITS區段通用引物進行PCR擴增，兩個病原菌菌株均獲得1條600 bp左右的擴增條帶(圖2)。經回收、純化及序列測定，HS3獲得1條545 bp的單一條帶，HS6獲得1條574 bp的單一條帶。將獲得的序列在GeneBank中進行BLAST比對，菌株HS3與層生鐮刀菌Fusariumproliferatum(登錄號KU984710)同源性高達100%，菌株HS6與平頭炭疽菌Colletotrichumfructicola(登錄號MF554835)的菌株同源性高達100%。選取同源性高低不同的菌株進行多重序列比較和系統發育分析，使用MEGA 5.1軟件以Neighbor-Joining法構建進化樹。進化樹(圖3)顯示，菌株HS3與Fusariumproliferatum(登錄號KU984710)、Fusariumequiseti(登錄號MG020725)具有很近的遺傳關系，菌株HS6菌株與Colletotrichumfructicola(登錄號MF554835)具有很近的遺傳關系。因此，通過病原菌的形態鑒定、rDNA-ITS序列分析和系統發育樹，確定引起浙江省紅肉火龍果果實采后病害的主要病原菌為層生鐮刀菌和平頭炭疽菌。

圖2 火龍果采后分離病原菌rDNA-ITS區PCR擴增 產物的電泳結果 Fig.2 Electrophoresis results on PCR products of rDNA-ITS from isolated strains

2.3 植物精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌在體外直接接觸抑制效果

選擇已經報道的對果蔬病原真菌有較好抑制效果的6種精油，采用體外直接接觸法，研究其對火龍果釆后主要病原菌層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑菌效果。結果如表1所示，香芹酚精油、肉桂精油、百里香精油在2 000 μL/L下對兩種病原菌生長的抑制率為100%，該用量下丁香精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑制率分別為92.7%和83.1%，羅勒精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑制率分別為65.3%和49.6%，芳樟醇對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑菌效果不明顯，抑制率分別為41.2%和43.9%。

選擇抑菌效果較好的3種精油(香芹酚精油、肉桂精油、百里香精油)，進一步研究其最低抑菌濃度(MIC)。由圖4可知，3種供試精油對2種病原菌菌絲生長均有不同程度的抑制作用，且隨濃度升高(125～2 000 μL/L)抑菌作用逐漸增強。肉桂精油和百里香精油在濃度達到1 000 μL/L時，完全抑制層生鐮刀菌和平頭炭疽菌菌絲的生長；香芹酚精油表現出較強的抑菌性，當濃度增加到500 μL/L時，完全抑制層生鐮刀菌菌絲的生長，在濃度為1 000 μL/L時，完全抑制平頭炭疽菌菌絲的生長。另外，結果表明，在添加等量精油時，對層生鐮刀菌的抑制效果好于對平頭炭疽菌的抑制效果(圖4)。因此，肉桂精油和百里香精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的MIC均為1 000 μL/L；香芹酚精油對層生鐮刀菌的MIC為500 μL/L，對平頭炭疽菌的MIC為1 000 μL/L。因此，3種精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的體外直接接觸抑菌效果的優劣排序為：香芹酚、百里香、肉桂精油。

圖3 基于ITS基因序列構建的病原菌HS3和HS6系統進化樹 Fig.3 Molecular phylogenetic tree based on ITS sequences of HS3 and HS6

Tab.1 Inhibition effect of different plant essential oils on mycelial growth of pathogens isolated from pitaya fruit%

注：所有數據在25℃培養4 d后測得，培養基均為PDA培養基；不同字母表示差異顯著(p≤0.05)，下同。

2.4 植物精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的體外熏蒸抑制效果

以體外熏蒸的抑菌試驗觀察香芹酚精油、肉桂精油、百里香精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑制效果，其結果如圖5所示，3種供試精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌均有不同程度的抑制作用，且隨每張濾紙片精油添加量的增加，抑菌能力逐漸增強。當精油添加量為4 μL時，香芹酚對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑制率均為100%，肉桂精油對層生鐮刀菌的抑制率為95.6%，對平頭炭疽菌的抑制率為72.6%，百里香精油對層生鐮刀菌的抑制率為87.9%，對平頭炭疽菌的抑制率為75.8%。當精油用量為5 μL時，香芹酚和百里香精油均能完全抑制層生鐮刀菌和平頭炭疽菌菌絲的生長，而肉桂精油對平頭炭疽菌的抑制率均僅為89.4%。因此，3種精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的體外熏蒸抑菌效果的優劣排序為：香芹酚、肉桂精油、百里香。

2.5 植物精油對火龍果采后病原菌的抑制效果

為了進一步研究3種植物精油的活體抑菌效果，采用人工接種的方法探討供試精油對火龍果果實致病菌的控制。由圖6可知，供試精油熏蒸處理降低了接種層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的火龍果低溫貯藏過程中的腐爛率。接種層生鐮刀菌的火龍果果實在貯藏16 d時，對照組腐爛率為44.5%，肉桂精油處理組為12.1%、百里香精油處理組為13.4%，而香芹酚處理組僅為6.7%。接種平頭炭疽菌的火龍果果實在貯藏20 d時，對照組腐爛率為52.4%，肉桂精油處理組為24.8%、百里香精油處理組為35.1%，而香芹酚處理組僅為18.6%。因此，綜合體外直接接觸、體外熏蒸以及活體抑菌試驗的結果，香芹酚精油對火龍果采后主要致病菌層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑制效果最好。

圖4 植物精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌體外直接接觸抑制效果 Fig.4 Inhibition effect of essential oils on mycelia growth of F. proliferatum and C. fructicola in vitro

圖5 植物精油對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌體外熏蒸抑制效果 Fig.5 Inhibition effect of essential oils on mycelia growth of F. proliferatum and C. fructicola in vitro by fumigation

圖6 植物精油對接種層生鐮刀菌和平頭炭疽菌火龍果低溫貯藏過程中腐爛率的影響 Fig.6 Effect of essential oils on decay incidence of pitaya fruit inoculated with F. proliferatum and C. fructicola during storage at 4℃

3 討論

通過形態學鑒定、分子鑒定和回接試驗，將浙江產區紅肉火龍果采后主要致病菌確定為層生鐮刀菌和平頭炭疽菌。層生鐮刀菌是鐮刀菌屬的重要植物病原真菌，可侵染水稻、小麥、玉米、蘆筍、大蒜、洋蔥等作物[22]，引起枯萎病、腐爛病等，也有研究表明該菌是芒果畸形病的主要病原菌[23]。已有尖孢鐮刀菌(F.oxysporum)[24]和單隔鐮刀菌(F.dimerum)[25]被報道為引起火龍果采后病害的致病菌。其中，層生鐮刀菌引起紅肉火龍果貯藏病害為國內的首次報道，平頭炭疽菌與朱迎迎等[26]有關海南進口火龍果的研究報道一致。

大量研究表明，植物精油大多具有殺菌、防腐等作用，能抑制果蔬采后病害的發生[12]。本文通過體外直接接觸法、體外熏蒸法和活體抑菌試驗，明確了香芹酚精油、肉桂精油和百里香精油對火龍果采后主要致病菌層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑制作用。周丹丹等[27]研究發現，丁香酚、檸檬醛和香芹酚能夠抑制枇杷采后尖孢炭疽菌的菌絲生長，并抑制炭疽病的發生；李素清等[28]研究發現，肉桂精油、百里香精油、丁香精油對獼猴桃采后病原菌尖孢炭疽菌有較好抑制作用。劉繼等[29]選擇6種精油進行抑菌性試驗，結果發現肉桂精油及百里香精油在2 000 μL/L時對生姜病原菌鐮刀菌的生長抑制率均為100%，同時，肉桂精油熏蒸處理使接種鐮刀菌的生姜感病率下降了59.33%。

香芹酚精油表現出較強的抑菌性，無論從直接接觸還是熏蒸的方式，其對層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑菌效果均好于肉桂精油和百里香精油。直接接觸方式下百里香精油的抑菌效果優于肉桂精油，熏蒸方式下，則肉桂精油的抑菌效果更好。同時，精油熏蒸處理使接種層生鐮刀菌和平頭炭疽菌火龍果腐爛率下降，且香芹酚精油的效果最好，活體抑菌試驗則進一步證實該結果(圖6)。分析其原因，是由于植物精油成分復雜，所以其抑菌機理也相對復雜，不同組分精油的抑菌作用及抑菌機制也不盡相同[30-31]。以熏蒸方式作用病原菌時，主要是精油的揮發性組分接觸到菌絲；而以直接接觸方式作用病原菌時，植物精油中的所有成分均可直接接觸到病原菌菌絲，而肉桂精油的揮發性成分的抑菌效果優于百里香精油的揮發性成分，這可能是不同的處理方式下兩種精油抑菌效果不同的原因之一。綜上所述，香芹酚精油作為火龍果貯藏前的熏蒸劑有較好的應用前景。

4 結束語

經病原菌形態學和分子生物學鑒定，證實浙江省紅肉火龍果采后貯藏期腐爛病害是由層生鐮刀菌和平頭炭疽菌兩種病原真菌引起。研究結果可為研究紅肉火龍果采后病害發生規律研究及進一步制定切實有效的綜合防治措施提供參考依據。同時，比較了肉桂精油、百里香精油和香芹酚精油對火龍果采后主要病原菌層生鐮刀菌和平頭炭疽菌的抑制作用，發現香芹酚精油具有較好的抑菌效果。香芹酚精油作為火龍果貯藏前的熏蒸劑有較好的應用前景，但具體的抑菌機制仍需進一步研究。研究結果對提高火龍果貯藏品質、延長保鮮期提供了新的技術途徑和理論指導。