雙效工程菌Y1溶藻產(chǎn)物的急性毒性與健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

潘瑞松，沈紅池，吳旭鵬，蔡慶慶，王明新，張文藝

(1.常州大學(xué) 環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 常州 213164；2.常州環(huán)保科技開發(fā)推廣中心，江蘇 常州 213022)

中國南方飲用水多取自于淡水湖泊、河流及水庫。隨著水體富營養(yǎng)化的加重，水源地藍(lán)藻爆發(fā)日益頻繁[1-2]。藍(lán)藻爆發(fā)不僅導(dǎo)致水質(zhì)下降，還會(huì)產(chǎn)生藻毒素，其中微囊藻毒素(Microcystins,MCs)具有極強(qiáng)的肝、腸致癌毒素，嚴(yán)重危害著人們的健康，所以保護(hù)水源水迫十分急迫[3-5]。生物法是近年來興起的、利用溶藻細(xì)菌控制水體藻類繁殖的一種控藻方法，其基本控藻機(jī)制一是通過直接與藻接觸殺藻，二是通過菌分泌的胞外物質(zhì)殺藻[6-7]。但對(duì)溶藻產(chǎn)物及藻溶解后生物殘留物的急性毒性、健康風(fēng)險(xiǎn)和致突變鮮有研究[8]。

發(fā)光細(xì)菌是一種在自然狀態(tài)下能夠發(fā)出熒光的細(xì)菌，現(xiàn)廣泛應(yīng)用于水、土壤、沉積物等方面的毒性測(cè)定，是一種快捷、高效、廉價(jià)的毒性測(cè)試方法[9-11]。健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)是評(píng)價(jià)人體長(zhǎng)期攝入某種有害物質(zhì)后對(duì)人類造成的傷害[12-14]。而為了確保居民飲用水安全，對(duì)含MC的水可能造成的危害進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)是十分必要的。健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)采用模型計(jì)算有毒物質(zhì)對(duì)人群的影響，美國(USEPA)推薦的模型是較為常用的評(píng)估模型[15-16]。

將已構(gòu)建的溶藻和藻毒素雙效工程菌Y1制成菌劑，利用發(fā)光細(xì)菌研究其對(duì)銅綠微囊藻降解產(chǎn)物的毒性。采用美國環(huán)保署EPA推薦的健康風(fēng)險(xiǎn)模型——有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型公式[15]對(duì)水源水、曝氣生物濾池(BAF)處理水和Y1菌劑強(qiáng)化處理水進(jìn)行健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。

1 材料與方法

1.1 菌劑培養(yǎng)基和菌種

1)菌種：采用本課題組專利“一種溶藻/藻毒素降解雙效工程菌Y1及其構(gòu)建方法(專利201310419121.5)”中的菌劑Y1菌(Bacillussphaericus，保藏號(hào)CGMCC NO.7519)。

2)培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 15 g，蒸餾水1 L，pH 7.2～7.4。

1.2 銅綠微囊藻來源及培養(yǎng)

選用的藻種為銅綠微囊藻(M.aeruginosa)FACHB-905，購于中科院武漢水生生物研究所國家淡水藻種庫。將購買的藻靜置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)箱條件：溫度28℃、光照強(qiáng)度2 500 lx、光照周期比12 h∶12 h。

1.3 菌劑Y1制備方法

用接種環(huán)取斜面培養(yǎng)基上的Y1菌置于高壓滅菌后的液體培養(yǎng)基內(nèi)在140 r·min-1的震蕩箱內(nèi)恒溫震蕩24 h。

1)菌液投加比對(duì)溶藻產(chǎn)物的急性毒性試驗(yàn) 將培養(yǎng)18 h的菌液分別以菌藻比1∶5，1∶10，1∶20的量投加，并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，取樣測(cè)定葉綠素a的濃度和培養(yǎng)液急性毒性。

2)初始藻液質(zhì)量濃度的溶藻產(chǎn)物急性毒性試驗(yàn) 將培養(yǎng)18 h的菌液分別以菌藻比1∶10的量投加到不同初始濃度的新鮮藻液中，并于溫度28 ℃、光強(qiáng)2 500 lx、光暗周期12 h∶12 h條件下，在光照培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，取樣測(cè)定葉綠素a的濃度和培養(yǎng)液急性毒性。

1.4 檢測(cè)方法

1)葉綠素a的測(cè)定：Chla測(cè)定[17]：參照國家環(huán)保總局編的《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法(第四版)》，其中的丙酮用乙醇代替。

2)發(fā)光細(xì)菌急性毒性測(cè)定:發(fā)光細(xì)菌遇到毒性物質(zhì)，發(fā)光會(huì)受到抑制。對(duì)照和樣品均設(shè)兩個(gè)平行管，將管子按照順序排布，凍干菌劑用稀釋液活化15 min后，加100 μL到每個(gè)試管中，過15 min后測(cè)空白。以NaCl稀釋液作為對(duì)照，2 000 μL待測(cè)樣品加入200 μL調(diào)解液混勻，兩個(gè)平行管每管900 μL，過15 min后測(cè)發(fā)光亮。

cF=b/a

e%=c×cF-d/c×cF×100%

相對(duì)發(fā)光度%=1-e

式中：a為對(duì)照組的空白；b為對(duì)照組測(cè)定數(shù)據(jù)；cF為對(duì)照組的相對(duì)剩余發(fā)光度；c為樣品組的空白；d為樣品組測(cè)定數(shù)據(jù)；e為光損。

1.5 BAF處理水源水健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)方法

國際癌癥研究署(IARC)將化學(xué)物的分類為Ⅰ級(jí)(致癌)、ⅡA級(jí)(很可能致癌)、ⅡB級(jí)(可能致癌)、Ⅲ級(jí)(無法歸類)和Ⅳ級(jí)(很可能不致癌)。MC-LR屬于ⅡB級(jí)，對(duì)人類致癌性證據(jù)有限[18]。非致癌風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算公式為[19]

(1)

式中：RfD為MC-LR進(jìn)入人體的參考劑量(mg/kg·d)。目前尚無MC-LR的RfD的值，國際上通用0.04 μg/(kg·d)作為其值；CDI為長(zhǎng)期通過飲用水方式每日每千克體重下的攝入量mg/(kg·d)。

在飲水途徑暴露下，CDI的計(jì)算公式為

(2)

式中：C為水源水中MC-LR所存在的濃度，mg/L；IR為成人飲水率，USEPA建議值為2 L/d；EF為暴露于致癌物質(zhì)的頻率，即接觸含MC-LR水的頻率，定該值為365 d/a；ED為接觸MC-LR總共所持續(xù)的時(shí)間，USEPA推薦的數(shù)值為30 a；BW為攝入MC-LR的人體體重，通過國家標(biāo)準(zhǔn)設(shè)為60 kg；AT為接觸引用水的時(shí)間，對(duì)于非致癌健康風(fēng)險(xiǎn)該值為ED×365 d/a[20]。

1.6 有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型

研究表明水質(zhì)參數(shù)如氮磷、COD、pH和 UV254等數(shù)值與致突變強(qiáng)度有密切聯(lián)系。學(xué)者們就水質(zhì)參數(shù)與致突變強(qiáng)度(Mutation Rate,MR)建立了多種模型[21]。建立水質(zhì)參數(shù)與致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型能為水環(huán)境監(jiān)測(cè)部門提供檢測(cè)水質(zhì)毒性強(qiáng)度的便捷方法。有關(guān)于UV254與致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型，在此模型中以UV254數(shù)值作為自變量，以定量水樣致突變強(qiáng)度為因變量。多項(xiàng)研究揭示了UV254和溫度與水質(zhì)有機(jī)物致突變強(qiáng)度有較高的相關(guān)性。本研究采用多元回歸方程

MR=12.749×UV254+0.054×temp+0.312，引入U(xiǎn)V254和溫度2個(gè)指標(biāo)[22]。

2 結(jié)果與討論

2.1 菌液投加比例對(duì)溶藻產(chǎn)物的急性毒性

將初始葉綠素a濃度34.92 mg/m3的藻液加入不同菌量于28 ℃光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)6 d，測(cè)定空白樣和加菌樣的葉綠素a，發(fā)現(xiàn)加入菌劑Y1均能對(duì)銅綠微囊藻產(chǎn)生降解作用。隨著時(shí)間的增加降解率提高，在第6 d葉綠素a的量均為0。在此基礎(chǔ)上，研究不同菌藻比對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性研究，以未加菌液的銅綠微囊藻為對(duì)比，在第3 d時(shí)，空白、1∶10、1∶5的相對(duì)放光度都降低了，而菌藻比1∶20的相對(duì)發(fā)光度上升了，到了第6 d，各溶液的相對(duì)發(fā)光度繼續(xù)減少，投菌量越多，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制作用越強(qiáng)，藻細(xì)胞經(jīng)過Y1菌的降解毒性反而增強(qiáng)了。可能的原因是藻量較少導(dǎo)致菌大量繁殖，而Y1菌為球形芽孢桿菌，球形芽孢桿菌能夠作為殺蚊劑，具有一定的毒性[23]。

圖1 菌藻比對(duì)溶藻產(chǎn)物毒性影響Fig.1 Effect of algae ratio on the acute toxicity

圖2 不同初始濃度對(duì)溶藻產(chǎn)物毒性影響Fig.2 Effect of the initial Microcystis aeruginosa concentration on the acute toxicity of algae-lying

2.2 初始藻液質(zhì)量濃度對(duì)溶藻產(chǎn)物急性毒性影響

在初始葉綠素a濃度分別為34.92 mg/m3、46.56 mg/m3、58.2 mg/m3的藻液中投加1∶10的Y1菌液，由圖可知，Y1菌液對(duì)不同初始濃度的藻液均有降解效果。在第3 d分別降解至21.22 mg/m3、21.12 mg/m3、23.38 mg/m3，初始濃度高抑制效果更好，處理6 d后Y1菌均能將藻完全殺死。對(duì)于不同初始濃度的藻液進(jìn)行發(fā)光細(xì)菌的毒性研究，從第1 d的數(shù)據(jù)可以看出，藻初始濃度越高對(duì)發(fā)光細(xì)菌的抑制能力越強(qiáng)。隨著未加菌樣葉綠素a濃度的提高，其相對(duì)發(fā)光度隨之降低，藻濃度越高，相對(duì)發(fā)光度越低。加入1∶10的Y1菌液后，濃度2和3的水樣相對(duì)發(fā)光度雖然降低，但與對(duì)照組相比，其對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性并沒有那么強(qiáng)。菌液作用6 d后，處理組的相對(duì)發(fā)光度分別為71.75%、77.10%、69.47%，而對(duì)照組為80.02%，66.63%，66.47%。說明水樣中微量的藻毒性較小，而藻濃度較高時(shí)，水中的藻毒素的含量因藻的代謝和破裂比低濃度時(shí)更高[24]，Y1菌劑是溶藻和降解藻毒素的雙效工程菌，投加菌劑后既能溶解藻又將產(chǎn)生的藻毒素也降解了，能夠有效的降低水質(zhì)的急性毒性。

2.3 BAF進(jìn)出水源水健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)

向其中一個(gè)BAF裝置中投加250 mL 1.87×105cfu·mL-1的Y1菌液。以BAF裝置處理的進(jìn)出水樣中MC-LR質(zhì)量濃度為基礎(chǔ)，運(yùn)用式(2)計(jì)算出MC-LR的長(zhǎng)期攝入量并通過非致癌風(fēng)險(xiǎn)值計(jì)算式(1)計(jì)算出R值。通過BAF工藝處理過的水源水MC-LR濃度都下降了。由測(cè)定的藻毒素含量可知未加菌的1號(hào)BAF進(jìn)水MC-LR濃度在2.89～4.75 μg/L之間，而加菌的2號(hào)BAF進(jìn)水MC-LR濃度在3.34～4.87 μg/L之間，1號(hào)出水濃度為1.56～3.33 μg/L，2號(hào)加菌處理后的濃度在0.72～3.37 μg/L。水樣中MC-LR的R值為2.4 ～ 4.05，經(jīng)過處理之后水樣的毒性均減小了，1號(hào)BAF工藝出水R值最低1.3，最高2.8，而加菌以后對(duì)MC-LR的去除效率更高，R值為0.6 ～ 2.8。

表1 投菌和未投菌的BAF處理水中MC-LR濃度Table 1 The concentration of MC-LR in the treated water of BAF with and without bacteria Y1

通常認(rèn)為R值>1對(duì)人的身體有害，R值≤1對(duì)人的身體危害較小[25]。通過上述計(jì)算可知處理前的水中MC-LR的R值均>1，原水中MC-LR含量超標(biāo)嚴(yán)重影響人體健康，經(jīng)過BAF處理后出水的R值明顯減小，但由于原水樣的MC-LR濃度過高，處理后的水樣仍然損害人體，加菌處理的水樣處理效果比未加菌的樣好，處理完的水最低R值達(dá)到0.6，小于1，符合要求。

2.4 有機(jī)物致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型

從3月28日至4月29日中選取8 d測(cè)定水溫和Y1菌強(qiáng)化后BAF裝置的進(jìn)出水UV254數(shù)值。通過測(cè)得的數(shù)據(jù)可知，經(jīng)過處理后水的UV254遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于進(jìn)水值。UV254數(shù)值能夠很好的確定水中大分子有機(jī)物的量，這些大分子包括一些能致癌的芳香族化合物。通過回歸方程計(jì)算得到不同UV254下的回復(fù)突變率MR。通常認(rèn)為MR>2則有致突變性，而MR≤2即為無致突變性。未經(jīng)處理的源水MR在2.24 ～ 3.06之間，均大于2具有致突變性，而經(jīng)過處理后水的MR在0.46 ～ 0.85之間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于2，基本清除致突變性。

表2 有機(jī)物致突變強(qiáng)度Table 2 Mutagenicity of organic compounds

3 結(jié)論

1)由于Y1菌為球形芽孢桿菌具有一定毒性，當(dāng)藻濃度過低時(shí)加入Y1菌劑的毒性要比不加菌高。而藻濃度越高，對(duì)發(fā)光細(xì)菌毒性越大，加菌后葉綠素a濃度降低，對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性也隨之降低，分析說明溶藻產(chǎn)物對(duì)發(fā)光細(xì)菌的毒性并不大。

2)健康分險(xiǎn)評(píng)價(jià)模型分析表明，未經(jīng)BAF處理過的水中MC-LR的R值為2.4～4.05，對(duì)人體的傷害很大，處理過后的水R值明顯減少為1.3～2.8，加Y1菌的BAF出水MC-LR的R值最低達(dá)到0.6，低于基準(zhǔn)值，無健康風(fēng)險(xiǎn)。UV254與致突變強(qiáng)度的預(yù)測(cè)模型分析表明，處理前的水中有機(jī)物MR>2，具有致突變性，而經(jīng)過處理的水MR遠(yuǎn)小于2，基本無致突變性，說明Y1應(yīng)用于水源水無生物毒性和致突變風(fēng)險(xiǎn)。