飲食誘導小鼠肥胖模型中胃食管黏膜的變化研究

買買提·依斯熱依力 艾克拜爾·艾力 吾布力卡斯木·吾拉木 伊比提哈爾·買買提艾力 巴突爾·艾克木 王儉 艾熱夏提·吐洪江 曹正一 阿布拉江·米吉提 趙新勝 克力木·阿不都熱依木

隨著人類飲食結構的變化，高能量值食物的攝取量不斷提高，由飲食結構不合理引起的肥胖癥逐漸引起了人們的關注。在消化系統良性疾病中，很多疾病的發生與肥胖有關，其中常見的包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)、非酒精性脂肪肝、膽囊結石及胰腺炎等[1]。同時肥胖癥的患病率在全球范圍內不斷增長，已成為了一項世界公共健康問題。GERD同樣作為常見的消化道良性疾病，其與飲食習慣間的相關性不可忽視。近年國內外許多研究者通過飲食誘導肥胖(diet-induced obesity，DIO)動物模型來探討肥胖和相關代謝性疾病的發病機制[2-3]。然而該模型在上述領域中被廣泛應用，使得模型的成功建立已基本成熟，但其在GERD研究中的應用很少見。因此本研究旨在探討肥胖與GERD的相關性及DIO動物模型在該研究中的價值，以為今后肥胖與GERD相關性研究提供實驗基礎。

資料與方法

一、一般資料

1. 實驗動物及分組：SPF級雄昆明小鼠20只，8周齡，購于新疆實驗動物研究中心，許可證號：SCXK(新)2011-0001；飼養于新疆維吾爾自治區維吾爾醫藥研究所IVC系統動物中心。研究員對20只小鼠進行編號及體質量測量，并排除體重變異較大的4只。采用Microsoft Office Excel軟件隨機分2組(各8只)，即飲食誘導肥胖組(diet-induced obesity,DIO)組和正常對照(normal control，NC)組。小鼠以4只/籠飼養在自由進食水的鼠籠內，每日給予12 h晝夜循環，光照均始于北京時間8∶30分，止于20∶30分。

2. 實驗器材:電子天平(EL-5.2K)，常州市天之平儀器設備有限公司；低溫高速離心機(1-14K)，德國Sigma公司；抗凝采血管，美國BD公司；光學顯微鏡(Eclipse E200)，日本尼康公司；三諾安穩血糖儀及血糖試條，三諾生物傳感股份有限公司；D-葡萄糖，德國Sigma公司；HE染色相關試劑，北京中杉金橋生物技術有限公司。

二、方法

1. DIO模型的建立:正式實驗前，將所有小鼠在相同環境中標準飼料適應性喂養1周。9周齡時開始建立模型，DIO組小鼠給予高脂飼料(HFD,Lot:11111401,60%KJ%fat,D12492,Research Diets Inc.21.92 KJ/g)，NC組給予標準飼料(STD，Lot：08101506,10%KJ%fat，D12450B，Research Diets Inc.16.11 KJ/g)，飼料成分見表1，其余處理均相同。實驗過程中小鼠自由飲水攝食，持續8周。每周3上午10∶00(北京時間)測量體質量與飲食量。8周的飼養結束后，DIO組小鼠中體質量超過NC組最高體質量者可被視為肥胖小鼠。

表1 HFD與STD成份及能量值(%)

注：STD為標準飼料；HFD為高脂飼料

2. 取材與標本處理：實驗第8周最后1天下午17∶00(北京時間)開始對所有小鼠禁食，于次日11∶00(北京時間)進行取材。將麻醉的動物以平臥位固定，從腹部正中至劍突取3 cm切口，下腔靜脈取血注入于肝素抗凝采血管中。肉眼觀察皮下、腹股溝、腸系膜及各臟器周圍脂肪，完整游離取材并稱重；此外在距離胃食管交界處0.3和1.5 cm處剪斷取下胃食管組織，置于4%中性甲醛固定。

3. 血生化指標的測定：裝入采血管的血樣品以3 500 rpm/min的速度低溫離心5 min，取上層血清，-80 ℃保存，用于后續生化指標測定。采用ELISA法檢測甘油三酯，總膽固醇，低密度脂蛋白含量。實驗過程及測量指標濃度的計算嚴格按試劑盒說明書進行。

4. 口服葡萄糖耐量試驗(OGTT)與胰島素耐受試驗(ITT):參照Uchida[4]和Yisireyili等[5]研究者的方法進行實驗，步驟如下：實驗第8周最后1 d下午17∶00(北京時間)開始對所有小鼠禁食，于次日11∶00(北京時間取材前進行試驗。GTT：試驗開始前測血糖濃度，然后腹腔內以2 g/kg的量注射D-葡萄糖，并在注射后30、60、90、120 min分別監測血糖；ITT實驗：GTT試驗結束后向小鼠腹腔內注射胰島素0.75 U/kg，其后分別在15、30、45、60 min分別檢測血糖并記錄。參照王科等[6]的實驗方法計算GTT、ITT曲線下面積(area under curve,AUC)。

5. 小鼠組織病理學檢查:4%中性甲醛固定24 h后水洗、脫水、透明、浸蠟、包埋，制成5 μm厚切片行HE染色。切片質量及各組織形態學改變均由富有經驗的病理科醫師診斷。

三、統計學方法

結 果

一、NC組與DIO組小鼠體型、腹腔內脂肪分布、體重、進食量及血糖的比較

DIO組小鼠在體型上明顯比NC組小鼠體型大，并且NC組小鼠被毛順滑，而DIO組小鼠的被毛普遍有出油的現象(見圖1A)；經解剖腹腔2組進行比較發現，DIO組小鼠腸系膜、腹股溝及腹膜后等部位出現明顯的脂肪堆積(見圖1B,C,D)。體重為反應小鼠機體整體狀況的基本指標。實驗開始前DIO組小鼠體質量為(22.31±0.52)g，NC組小鼠體質量為(22.60±0.31)g，2組差異無統計學意義(P>0.05)；8周的實驗過程中，DIO組小鼠平均每日進食量為(2.92±0.41)g，NC組為(2.68±0.30)g，2組差異無統計學意義(P>0.05)；實驗結束后DIO組小鼠體質量增加量為(23.16±2.82)g，NC組小鼠體質量增加量為(13.40±1.31)g，2組差異具有統計學意義(P<0.05),見表2。

二、NC組與DIO組小鼠血生化指標的比較

DIO組小鼠血漿總膽固醇，低密度脂蛋白水平明顯高于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)，甘油三酯水平略高于對照組，但差異無統計學意義(P>0.05),見表3。

組別例數平均每日進食量(g)體重增加量(g)NC組82.68±0.3013.40±1.31DIO組82.92±0.4123.16±2.82t值-1.30-8.86P值0.210.000

表3 血生化指標比較

三、NC組與DIO組小鼠糖耐量和胰島素耐受的變化

GTT結果顯示，試驗開始之初NC組和DIO組小鼠血糖上升明顯，DIO組小鼠血糖2 h內不能恢復之前濃度且維持在一個比較高的水平，而NC組2 h內能恢復到正常范圍內的濃度，經過計算AUC得知，DIO組小鼠與NC組小鼠在整體水平上有差異(P<0.05)，由此可見，DIO組小鼠已經出現了糖耐量異常的現象。ITT結果顯示，NC組小鼠血糖濃度有一次較大幅度的下降，2 h內能夠恢復之前的濃度；而CRS組小鼠的血糖只是略有下降，2 h不能恢復到原來的濃度。同樣經過計算曲線下面積得知，DIO組小鼠與NC組小鼠在整體水平上有差異(P<0.05)；說明胰島素已經不能充分發揮其正常的生理功能，可以初步估計機體已經出現了胰島素抵抗的現象，見圖2。

四、NC組與DIO組小鼠胃、食管組織學及其周圍脂肪的變化

經解剖發現DIO組小鼠除了腹腔內各部位脂肪嚴重堆積，在胃食管交界處周圍同樣出現了明顯的脂肪堆積；HE染色及鏡下觀察顯示，在DIO組小鼠食管胃組織可見充血，炎癥細胞(單核細胞、巨噬細胞)浸潤，但NC組未見明顯異常，見圖3。

圖3 2組小鼠胃食管外觀及組織病理學變化

討 論

隨著經濟的發展，人們生活水平的提高，肥胖及相關消化道疾病人群的數量近年來呈現一個迅速上升的趨勢，對人類健康帶來了不同程度的危害。其中肥胖與GERD的相關性研究引起了越來越多的研究者的注意。GERD作為影響人類健康的消化道良性疾病之一，認為肥胖是其發生發展的重要因素[1]。全世界約10%～40%的成年人飽受著胃食管反流之痛[7]，同樣約有30%的人處于超重或肥胖狀態并呈逐年上升趨勢[8]。多項橫斷面流行病學研究報道稱，肥胖人群中GERD的發病率高于非肥胖人群[9-10]。El-Serag等[11]對453名醫院職工進行調查發現，26%的人每周都會出現燒心或反流癥狀；其中196名職工愿意接受進一步調查并進行了胃鏡檢查，結果顯示，不同BMI組，即BMI<25、25～30和>30 kg/cm2，存在GERD癥狀者所占的比例分別是23.3%、26.7%、50%，而糜爛性食管炎者所占的比例分別為12.5%、29.8%、26.9%。此外在其他研究中發現，增重>5 kg的人出現GERD癥狀的危險性為正常人的2.7倍[12]。故，在上述研究的基礎上，本課題組通過建立DIO動物模型，觀察肥胖所引起食管、胃的變化。

建模過程中，長期進食高脂飼料的模型組小鼠，體質量明顯高于標準飼料喂養組，其中75%的小鼠發育為DIO。整個造模期間，模型組小鼠體質量呈緩慢增長，雖然飲食誘導的肥胖小鼠動物模型的建立耗時長達2個月，但此模型較為真實地模擬了人類肥胖癥患者的病因和體重增長過程，即由長期高熱量飲食和缺乏運動的生活狀態所致。此肥胖模型動物伴有糖耐量異常、胰島素抵抗和脂質代謝紊亂，符合人類肥胖癥患者所具有的血液生化指標的變化，所以此模型可用于評價肥胖所誘導胃食管反流所引起的病理變化。對于該實驗中肥胖引起的胃食管的變化，我們發現DIO組小鼠腹腔內各部位脂肪堆積嚴重，更重要的是在胃食管交界處周圍同樣出現了明顯的脂肪堆積，這一變化初步驗證了“肥胖是引起胃食管反流的病理基礎”之一。進一步通過HE染色觀察2組小鼠食管、胃組織形態學變化時發現，食管及胃組織上皮細胞增厚、黏膜層各類炎癥細胞的浸潤等變化。因為，在胃食管炎癥進展和糜爛形成時，通常在鏡下可見沿食管長軸有條狀糜爛病變，也可見病變區域上皮壞死脫落，形成淺表性上皮缺損，其上由炎性纖維素膜覆蓋，其下可見中性粒細胞及淋巴細胞，漿細胞浸潤，炎癥改變。因此，DIO小鼠胃食管組織出現的組織學變化，相對接近肥胖導致胃食管反流的一個重要的病理變化。

綜上所述，目前關于肥胖所引起的GERD發病原因和機制尚不清楚。臨床研究往往因不易獲取倫理批準或患者知情同意、無法及時全面觀察機體病理生理變化及各層組織形態學變化等因素而受到限制，而動物實驗模型的建立解決了上述問題。然而DIO小鼠模型具有穩定性及重復性較好，操作簡單、費用低等優勢，并且整個造模期間，沒有動物死亡。因此，本實驗可以為后期進一步研究肥胖所引起GERD的機制提供較好的實驗基礎。