生物節律基因在宮頸癌中的表達及其臨床意義

韓小亞 周文柏 劉建兵 龍偉 張麗娜 張玢

宮頸癌是常見的惡性腫瘤之一,在全球婦女惡性腫瘤死亡率中居第四位。在全球范圍內,每年新發宮頸癌約529 800例，在發展中國家每年會導致275 100例死亡[1]。人類乳頭瘤病毒高危型感染會激活致癌基因、使腫瘤抑制基因失活[2]。此外，吸煙、多個性伴侶以及衛生狀況差都會增加宮頸癌發生的風險[3]。隨著宮頸癌疫苗的開發，宮頸癌篩查技術的普遍應用，宮頸癌的發病率和死亡率明顯下降[4，5]，但是其發病機制尚不清楚。近年來大量研究發現，生物節律維持睡眠-清醒周期、行為、代謝、激素分泌等生物行為以適當的節奏在體內運轉。目前臨床病例和實驗數據表明，生物節律關鍵基因有clock（circadian locomotor output cycles kaput）、per1（period 1）、per2（period 2）、per3（period 3）、cry1（cryptochrome 1）、cry2（cryptochrome 2）、bmal1（brain and muscle ARN-t like protein 1）、npas2（neuronal PAS domain protein 2）、rev-erb α（retinoic acid receptor-related orphan receptor α）、dec1（differentially expressed in chondrocyte 1）、dec 2（differentially expressed in chondrocyte 2）和 ckiε（casein kinase I ε）、cki δ（casein kinase I δ）、tim（timeless）共計14種，當體內生物節律發生紊亂，生物鐘基因可以通過調控鐘控基因的表達，直接或間接參與多種腫瘤的發生發展[6]。目前僅見生物節律tim基因在宮頸癌中的研究報道[7]。本研究期望通過在宮頸癌組織中生物節律正負反饋調控基因的表達差異的研究，探討生物節律基因在宮頸癌發生發展中的具體作用機制。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2015年11月～2017年8月宮頸鱗癌術后新鮮標本30例，及其對應的癌旁組織作為對照組（均經病理證實）。宮頸鱗癌患者均為初次接受手術，術前未接受放化療，年齡39～58歲，平均47.6歲。新鮮組織標本置于1.5ml離心管中加入1ml Trizol充分混勻，室溫靜置5min后放入-70℃冰箱保存備用。

1.2 引物設計與合成 clock、per、cry、bmal、tim 和內標β-actin引物由本實驗室設計，上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.3 組織總RNA制備 在冰上用組織勻漿器研磨至糊狀，加入0.2ml的氯仿，劇烈搖晃后靜置2min，12 000r/min離心10min后取上清，加入0.5ml異丙醇后靜置10min，12 000r/min離心10min后取沉淀，加入1ml的75%乙醇漂洗后干燥，溶于DEPC水中，定量總RNA濃度。

1.4 逆轉錄反應 參照Takara逆轉錄試劑盒（RR037A）說明書操作將總RNA逆轉錄為cDNA。cDNA樣本-20℃保存。

1.5 實時熒光定量PCR反應條件 95℃預變性1min，95℃變性 30s，62℃退火 30s，72℃延伸 1min，共35個循環；最后72℃延伸5min。所有PCR反應均在ABI 7500 PCR儀上進行。

1.6 RT-PCR產物的檢測 采用1.5%瓊脂糖凝膠對擴增合成的RT-PCR產物進行電泳。利用UVP凝膠成像系統對PCR產物條帶進行掃描，對電泳條帶灰度進行分析，將目標條帶灰度與擴增的β-actin條帶灰度的比值表示為各mRNA的相對表達水平。

1.7 統計學方法 采用SPSS 17.0統計學軟件進行分析。mRNA相對表達水平組間對比采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

表1 生物節律基因引物序列

2 結果

2.1 宮頸癌中生物節律基因clock的變化 宮頸癌組生物節律基因clock的表達為0.41±0.04，對照組為1.00±0.00，兩組比較差異具有統計學意義（t=2.65，P＜0.05）。

2.2 宮頸癌中生物節律基因bmal的變化 宮頸癌組及癌旁對照組的生物節律基因bmal的轉錄水平分別為0.86±0.14、1.00±0.00，兩組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 宮頸癌中生物節律基因per的變化 宮頸癌組及癌旁對照組的生物節律基因per1的轉錄水平分別為0.12±0.03、1.00±0.00，表達極顯著下調（t=7.22，P＜0.001）；per2基因表達分別為0.21±0.04、1.00±0.00，表達極顯著下調（t=6.89，P＜0.001）。

2.4 宮頸癌中生物節律基因cry的變化 宮頸癌組及癌旁對照組的生物節律基因cry1的表達為0.12±0.03及1.00±0.00，宮頸癌組顯著下調（t=2.98，P＜0.05），而 cry2的表達為 0.14±0.04與對照組相比極顯著下調（t=6.98，P＜0.001）。

2.5 宮頸癌中生物節律基因tim的變化 宮頸癌組及癌旁對照組的生物節律基因tim的表達分別為2.9±0.067及1.00±0.00，宮頸癌組顯著上調（t=8.52，P＜0.001）。各生物節律基因的表達見圖1。

圖1 生物節律基因在宮頸癌中的表達情況

3 討論

在過去的幾十年間，現行的宮頸癌篩查已經大大降低了宮頸癌的死亡率，通過篩查能早發現早診斷早治療，現在甚至發病之前就可對其進行預防。然而隨著基于生物節律基因的研究，興起了一種新型的個體化治療模式。研究生物節律基因與宮頸癌之間的關聯性，可探尋宮頸癌的發病機制，找到更好的篩查方法及個性化診療方案。本研究結果表明，在人類宮頸癌發生過程中生物節律基因的轉錄水平存在明顯差異。

眾所周知，生物節律基因是由clock基因和bmal1基因通過 PAS（Per-Arnt-Sim）區域形成異二聚體，與受生物節律調節基因(包括per和cry)上游的E-box結合，啟動節律性基因轉錄；而per與cry表達升高后，形成的異二聚體可與clock和bmal1結合，反饋性抑制其轉錄功能。此外，由per和tim基因編碼的蛋白磷酸化后形成二聚體，在核內能夠延緩轉錄過程。因此，clock/bmal1二聚體激活的per和cry基因的轉錄過程被per/tim二聚體抑制，但隨著兩個二聚體蛋白之間相互作用的加強，per/tim二聚體出現轉變，負反饋作用減弱，轉錄過程被重新激活[8]。此外，tim與per1-3結合后能進入細胞核，抑制clock基因的活性，降低clock基因表達，從而終止生物鐘周期[9]。

clock基因作為第一個被發現的脊椎動物生物節律基因[10]，是目前研究最多的基因。諸多研究表明，多種腫瘤的發生及進展均與clock基因密切相關。clock基因與乳腺癌發病風險顯著相關[11]，在大腸癌、甲狀腺癌組織中clock基因mRNA呈高表達[12,13]。本研究在宮頸癌組織中發現了與其他腫瘤相反的clock基因的表達情況，clock基因的表達在宮頸癌組織較其配對的癌旁正常組織呈顯著下調，提示clock基因在正常組織中具有一定的生理作用。

目前生物節律基因per1和 per2的研究表明，其通過調控細胞周期相關基因的表達參與細胞周期的調控，并且per1和 per2的表達異常與多種腫瘤密切相關。在口腔鱗狀細胞癌、彌漫性大B細胞淋巴瘤、胃癌以及乳腺癌組織中，per1和per2的表達水平均降低[14～16]。本研究中，宮頸癌組織中的per1和per2同樣表現出顯著下調的情況，表明存在潛在的抑制細胞凋亡，最終導致癌變。per1和per2表達下調也可能引起基質金屬蛋白水解酶-2表達上調，同時加大層黏連蛋白受體-1在細胞膜上的分布，從而增強腫瘤的侵襲、遷移和轉移能力。

cry基因作為生物節律基因家族中最重要的成員之一，cry1與cry2均是負向反饋調節因子。其中cry1可以不依賴于per或兩者復合物，直接與clock或bmal1或clock/bmal1復合物起作用抑制轉錄，因此目前有學者認為cry1抑制活性強于任何per蛋白[17]。在妊娠期糖尿病、胰腺癌和結直腸癌的研究中發現cry基因與這些疾病發生并無相關性[18,19]。而本研究結果卻顯示cry1與cry2基因表達都發生明顯下調，這可能導致了晝夜節律的紊亂，從而誘發宮頸癌的發生。

通過本研究發現，宮頸癌中多個生物節律關鍵基因的表達發生了變化，clock、per1、per2、cry1和cry2均表達下調，這會直接影響異二聚體所形成的相對數量，從而使節律相位發生異常，造成生物節律系統紊亂，引發宮頸癌的發生。而tim基因表達上調，應當是機體對紊亂的生物節律系統的負向調控。

綜上所述，通過對宮頸癌中生物節律基因的初步研究，可知宮頸癌中的確存在著復雜的生物節律基因表達異常的情況，表明clock、per1、per2、cry1、cry2和tim均可能參與了宮頸癌的發生過程。然而，更多的機制研究將有助于進一步闡明各基因在宮頸癌發生中的確切作用，并有助于靶向治療策略。